간단한 2D 및 3D 세포 배양이 가능하도록 설계된 혁신적인 3D 프린팅 인서트
Summary
이 논문에서는 새로 설계된 3D 프린팅 인서트를 공동 배양 모델로 제시하고 내피 세포와 각질 세포 사이의 측분비 세포 간 통신 연구를 통해 검증합니다.
Abstract
서로 다른 세포 유형 간의 간접 통신에 대한 고전적인 분석에서는 조건화된 배지를 사용해야 합니다. 또한, 컨디셔닝 배지의 생산은 시간이 많이 걸리고 생리학적 및 병리학적 상태와는 거리가 멀다. 공동 배양의 몇 가지 모델이 상업적으로 이용 가능하지만 특정 분석으로 제한되며 대부분 두 가지 유형의 세포에 대한 것입니다.
여기에는 수많은 기능 분석과 호환되는 3D 프린팅 인서트가 사용됩니다. 인서트를 사용하면 6웰 플레이트의 웰 하나를 4개의 구획으로 분리할 수 있습니다. 다양한 조합을 설정할 수 있습니다. 또한, 창문은 구획의 각 벽에 설계되어 모든 구획 간의 잠재적인 세포 간 통신이 부피 의존적 방식으로 배양 배지에서 가능합니다. 예를 들어, 측분비 세포 간 통신은 단층, 3D(스페로이드) 또는 이 둘을 결합하여 4가지 세포 유형 간에 연구할 수 있습니다. 또한 서로 다른 세포 유형의 혼합을 2D 또는 3D(오가노이드) 형식으로 동일한 구획에 시딩할 수 있습니다. 3D 프린팅된 인서트에 바닥이 없기 때문에 플레이트의 일반적인 배양 조건, 인서트가 포함된 플레이트의 코팅 가능, 광학 현미경으로 직접 시각화할 수 있습니다. 다중 구획은 서로 다른 세포 유형을 독립적으로 수집하거나 각 구획에서 RNA 또는 단백질 추출을 위해 서로 다른 시약을 사용할 수 있는 가능성을 제공합니다. 본 연구에서는 새로운 3D 프린팅 인서트를 공동 배양 시스템으로 사용하기 위한 상세한 방법론을 제공합니다. 이 유연하고 간단한 모델의 여러 기능을 입증하기 위해 이전에 발표된 세포 통신의 기능적 분석이 새로운 3D 프린팅 인서트에서 수행되었으며 재현 가능한 것으로 입증되었습니다. 3D 프린팅된 삽입물과 컨디셔닝된 배지를 사용한 기존 세포 배양은 유사한 결과를 가져왔습니다. 결론적으로, 3D 프린팅 인서트는 부착 세포 유형을 가진 수많은 공동 배양 모델에 적용할 수 있는 간단한 장치입니다.
Introduction
생체 내에서 세포는 직접적으로(세포 접촉) 또는 간접적으로(분자 분비에 의해) 서로 통신합니다. 세포 통신을 연구하기 위해 직접 공동 배양(서로 다른 세포 유형이 동일한 웰에서 직접 상호 작용함) 및 구획화된 공동 배양(서로 다른 세포 유형이 배양 시스템의 서로 다른 구획에서 간접 상호 작용함)과 같은 다양한 공동 배양 모델을 개발할 수 있습니다1. 또한, 컨디셔닝 배지는 공동 배양 시스템에 사용될 수 있으며, 여기서 간접 상호작용은 반응자 세포 유형1로 전달되는 이펙터 세포 유형의 컨디셔닝 배지에 포함된 분비된 분자에 의해 활성화됩니다.
측분비 세포 통신 연구의 경우, 간접 공동 배양 시스템은 생체 내에서 세포 상호 작용을 강력하게 반영하는 모델을 제공합니다. 간접 공동 배양 시스템이 개발되고 상용화되어 간접 공동 배양 모델 2,3의 확립이 가능해졌습니다. 안타깝게도 대부분의 간접 공동 배양 시스템은 두 개의 구획만 제공합니다. 다른 간접 공동 배양 시스템은 여러 구획을 제공하지만 현재 원고에 보고된 시스템에 비해 확장성이 떨어집니다. 그들 중 일부는 현미경으로 고전적인 시각화를 허용하지 않으며 종종 특정 응용 방법을 제시합니다. 여러 연구에서, 상이한 세포 유형 사이의 측분비 통신은 조건화 된 배지 모델 4,5,6,7에 의해 조사된다. 이것은 특정 방법이나 재료를 확립할 필요가 없기 때문에 간접 공동 배양 시스템에 비해 조사가 더 쉬운 방법입니다1. 반면에, 컨디셔닝 배지의 준비는 시간이 많이 걸리고 단방향 세포 신호전달(이펙터에서 반응자로)에 대한 정보만 제공합니다1.
이 논문에서는 세포 통신을 조사하는 새롭고 간단한 방법을 제안합니다. 직접 또는 간접 상호 작용과 2D 또는 3D 형식에서 여러 세포 유형을 결합할 수 있는 인쇄된 인서트는 공동 배양 모델을 쉽게 설정할 수 있는 많은 이점을 제공합니다. 6웰 플레이트의 웰에 배치되도록 조정된 3D 프린팅 인서트는 원형이며 웰을 4개의 구획(2개의 큰 구획과 2개의 작은 구획)으로 분리할 수 있습니다. 그림 1A). 3D 프린팅 인서트는 바닥이 없는 것이 특징입니다. 따라서, 셀은 인서트가 놓인 플레이트와 직접 접촉한다. 또한, 각 구획은 다른 구획과 독립적으로 코팅될 수 있다. 또한, 세포 거동은 광학 현미경으로 쉽게 추적할 수 있습니다. 인서트의 각 벽에 통신 창이 있으면 최적의 시간에 공통 배지를 추가하여 서로 다른 공동 배양 실험을 수행할 수 있습니다. 여러 세포 유형 간의 직접 및/또는 간접 통신을 연구하기 위해 공동 배양의 수많은 조합을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 단층 및/또는 3D(스페로이드)에서 4개의 서로 다른 세포 유형 간의 간접 공동 배양 모델을 설계할 수 있습니다. 직접 및 간접 공동 배양 모델의 조합은 동일한 구획에서 서로 다른 세포 유형을 혼합하여 수행할 수도 있습니다. 복잡한 구조(오가노이드, 조직 외식편 등)가 다양한 세포 유형에 미치는 영향은 만들 수 있는 모델의 또 다른 예가 될 수 있습니다. 또한 3D 프린팅 인서트는 세포 생물학 기능 분석(증식, 이동, 유사관 형성, 분화 등) 및 생화학 검사(DNA, RNA, 단백질, 지질 추출 등)와 호환됩니다. 마지막으로, 3D 프린팅 인서트는 서로 다른 구획에서 동일한 실험에서 서로 다른 분석을 동시에 결합할 수 있는 가능성과 함께 공동 배양 모델의 광범위한 실험 계획을 제공합니다.
3D 프린팅된 인서트의 일부 용량은 빠르고 사용하기 쉬운 공동 배양 모델임을 검증하기 위해 제공됩니다. 측분비 세포 통신에 대해 수행된 이전에 발표된 연구와 비교하여 3D 프린팅 삽입물이 가치 있는 공동 배양 모델이 될 수 있는 능력이 입증되었습니다. 이 점을 평가하기 위해 각질 세포에 의한 내피 세포 증식 및 이동 조절을 3D 프린팅 삽입 시스템과 조건 매체를 사용하는 기존 시스템 간에 비교했습니다. 3D 프린팅 인서트는 컨디셔닝 미디어를 사용하는 기존 시스템과 비교하여 유사한 결과를 빠르게 얻을 수 있습니다. 실제로, 3D 프린팅된 인서트는 컨디셔닝된 배지를 생성할 필요 없이 양방향으로 세포 상호작용을 연구할 수 있는 강력한 모델을 제공하며, 동일한 실험에서 증식 및 이동 분석을 병렬로 수행할 수 있습니다.
결론적으로, 이 논문에서는 세포 통신을 연구하기 위한 새롭고 즉시 사용 가능한 모델을 제안합니다. 모든 부착 세포 유형과 호환되는 3D 프린팅 인서트를 사용하면 생체 내 조건에 더 가까워지는 것을 목표로 하는 다양한 공동 배양 조합을 수행할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
간접 세포 통신은 일반적으로 조건화된 배지 또는 공동 배양 시스템 장치를 사용하여 조사됩니다. 조건화된 배지 준비는 실험의 업스트림에서 시간이 많이 소요되며, 이 방법은 단측 효과 분석으로 제한됩니다. Colin-Pierre et al.의 이전 연구.8 컨디셔닝 배지를 사용하여 두 세포 유형(HDMEC 및 KORS) 간의 간접 세포 통신에 대해 수행되었습니다. 이 이전 연구의 데이터는 HDMEC 증?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 BASF Beauty Care Solutions와 공동으로 이루어졌습니다. Charlie Colin-Pierre는 BASF / CNRS가 후원하는 박사 학위 펠로우입니다.
3D 프린팅 인서트의 개념에 대해 Mr. Mehdi Sellami에게 감사드립니다.
Materials
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
References
- Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer. Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions. Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).
- Lin, J., et al. Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).
- Soares, N. L., et al. Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role. Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).
- Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks. Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).
- Mercatali, L., et al. Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
- Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro. Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).
- Colin-Pierre, C., et al. The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).
- Toubal, A., et al. The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration. European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).
- Wu, A. -. L., et al. Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration. Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).
- Oudart, J. -. B., et al. Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX. Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).
- Martinotti, S., Ranzato, E. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. 2109, 225-229 (2020).
- Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).
- Ma, Y. N., et al. Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle. Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).
