Een innovatief 3D-geprint inzetstuk dat is ontworpen om eenvoudige 2D- en 3D-celculturen mogelijk te maken
Summary
In dit artikel wordt een nieuw ontworpen 3D-geprinte insert gepresenteerd als een model van co-cultuur en gevalideerd door de studie van de paracriene intercellulaire communicatie tussen endotheelcellen en keratinocyten.
Abstract
De klassieke analyses van indirecte communicatie tussen verschillende celtypen vereisen het gebruik van geconditioneerde media. Bovendien blijft de productie van geconditioneerde media tijdrovend en ver verwijderd van fysiologische en pathologische omstandigheden. Hoewel een paar modellen van co-cultuur in de handel verkrijgbaar zijn, blijven ze beperkt tot specifieke testen en zijn ze meestal voor twee soorten cellen.
Hier worden 3D-geprinte inserts gebruikt die compatibel zijn met tal van functionele assays. Het inzetstuk maakt de scheiding van één put van een 6-well plaat in vier compartimenten mogelijk. Er kan een breed scala aan combinaties worden ingesteld. Bovendien zijn ramen in elke wand van de compartimenten zo ontworpen dat potentiële intercellulaire communicatie tussen elk compartiment op een volumeafhankelijke manier in het kweekmedium mogelijk is. Paracriene intercellulaire communicatie kan bijvoorbeeld worden bestudeerd tussen vier celtypen in monolaag, in 3D (sferoïden) of door beide te combineren. Bovendien kan een mix van verschillende celtypen in hetzelfde compartiment worden gezaaid in 2D- of 3D-formaat (organoïden). De afwezigheid van een bodem in de 3D-geprinte inzetstukken maakt de gebruikelijke kweekomstandigheden op de plaat, mogelijke coating op de plaat met de insert en directe visualisatie door optische microscopie mogelijk. De meerdere compartimenten bieden de mogelijkheid om verschillende celtypen onafhankelijk van elkaar te verzamelen of om in elk compartiment verschillende reagentia te gebruiken voor RNA- of eiwitextractie. In deze studie wordt een gedetailleerde methodologie gegeven om de nieuwe 3D-geprinte insert te gebruiken als een co-cultuursysteem. Om verschillende capaciteiten van dit flexibele en eenvoudige model aan te tonen, werden eerder gepubliceerde functionele assays van celcommunicatie uitgevoerd in de nieuwe 3D-geprinte inserts en werden aangetoond dat ze reproduceerbaar zijn. De 3D-geprinte inserts en de conventionele celcultuur met behulp van geconditioneerde media leidden tot vergelijkbare resultaten. Kortom, de 3D-geprinte insert is een eenvoudig apparaat dat kan worden aangepast aan tal van modellen van co-culturen met aanhangende celtypen.
Introduction
In vivo communiceren cellen direct (celcontact) of indirect (door afscheiding van moleculen) met elkaar. Om celcommunicatie te bestuderen, kunnen verschillende cocultuurmodellen worden ontwikkeld, zoals directe cocultuur (de verschillende celtypen zijn in directe interactie in dezelfde put) en gecompartimenteerde cocultuur (de verschillende celtypen zijn in indirecte interactie in verschillende compartimenten van een cultuursysteem)1. Bovendien kunnen geconditioneerde media worden gebruikt voor co-cultuursystemen, waarbij de indirecte interactie mogelijk wordt gemaakt door uitgescheiden moleculen in de geconditioneerde media van een effectorceltype dat wordt overgebracht naar een responderceltype1.
In het geval van paracriene celcommunicatiestudies bieden indirecte cocultuursystemen modellen die celinteracties in vivo sterk weerspiegelen. Indirecte co-cultuur systemen zijn ontwikkeld en gecommercialiseerd, waardoor de oprichting van indirecte co-cultuur modellen 2,3. Helaas bieden de meeste indirecte co-cultuursystemen slechts twee compartimenten. Andere indirecte co-cultuursystemen bieden meerdere compartimenten, maar ze zijn minder schaalbaar in vergelijking met het systeem dat in dit manuscript wordt gerapporteerd. Sommigen van hen laten geen klassieke visualisatie onder een microscoop toe en ze presenteren vaak specifieke toepassingsmethoden. In verschillende studies wordt de paracriene communicatie tussen verschillende celtypen onderzocht door het geconditioneerde mediamodel 4,5,6,7. Dit is een gemakkelijkere manier van onderzoek in vergelijking met indirecte cocultuursystemen, omdat het geen specifieke methoden of materialen vereist om te worden vastgesteld1. Aan de andere kant is de voorbereiding van geconditioneerde media tijdrovend en levert alleen informatie op over eenrichtingscelsignalering (effector naar responder)1.
In dit artikel wordt een nieuwe, eenvoudige manier voorgesteld om celcommunicatie te onderzoeken. Door de combinatie van verschillende celtypen in directe of indirecte interactie en in 2D- of 3D-formaten mogelijk te maken, bieden de geprinte inserts tal van voordelen voor het eenvoudig opzetten van co-cultuurmodellen. Aangepast om in de putten van 6-putplaten te worden geplaatst, is het 3D-geprinte inzetstuk cirkelvormig en maakt het scheiding van de put in vier compartimenten mogelijk (twee grote compartimenten en twee kleine compartimenten; Figuur 1A). De 3D-geprinte inzetstukken kenmerken zich door de afwezigheid van een bodem. De cellen staan dus in direct contact met de plaat waarop de insert is geplaatst. Bovendien kan elk compartiment onafhankelijk van de andere worden gecoat. Bovendien kan het celgedrag gemakkelijk worden gevolgd onder optische microscopen. De aanwezigheid van communicatievensters in elke wand van de insert maakt de toevoeging, op het optimale moment, van een gemeenschappelijk medium mogelijk om verschillende experimenten van co-cultuur uit te voeren. Talrijke combinaties van co-cultuur kunnen worden uitgevoerd om directe en / of indirecte communicatie tussen verschillende celtypen te bestuderen. Zo kan een model van indirecte cocultuur tussen vier verschillende celtypen in monolaag en/of in 3D (sferoïden) worden ontworpen. Een combinatie van directe en indirecte co-cultuurmodellen kan ook worden uitgevoerd door verschillende celtypen in hetzelfde compartiment te mengen. Het effect van complexe structuren (organoïden, weefselexplant, enz.) op verschillende celtypen zou een ander voorbeeld kunnen zijn van modellen die kunnen worden gemaakt. Bovendien zijn de 3D-geprinte inserts compatibel met functionele assays van de celbiologie (proliferatie, migratie, pseudobuisvorming, differentiatie, enz.) en met biochemische tests (de extractie van DNA, RNA, eiwitten, lipiden, enz.). Ten slotte bieden de 3D-geprinte inserts een breed scala aan experimentele schema’s van co-cultuurmodellen met de mogelijkheid om tegelijkertijd verschillende assays in hetzelfde experiment in de verschillende compartimenten te combineren.
Sommige capaciteiten van de 3D-geprinte inserts worden gepresenteerd om ze te valideren als een snel en eenvoudig te gebruiken co-cultuurmodel. In vergelijking met een eerder gepubliceerde studie uitgevoerd op paracriene celcommunicatie, wordt het vermogen van de 3D-geprinte inserts om een waardevol co-cultuurmodel te zijn, aangetoond. Om dit punt te beoordelen, werd de regulatie van endotheelcelproliferatie en migratie door keratinocyten vergeleken tussen het 3D-geprinte insertsysteem en het klassieke systeem met behulp van geconditioneerde media. De 3D-geprinte wisselplaten maken het mogelijk om snel vergelijkbare resultaten te verkrijgen in vergelijking met het conventionele systeem met behulp van geconditioneerde media. De 3D-geprinte inserts bieden inderdaad een robuust model om celinteracties in beide richtingen te bestuderen zonder de noodzaak om geconditioneerde media te produceren en met de mogelijkheid om parallel de proliferatie- en migratietests in hetzelfde experiment uit te voeren.
Tot slot wordt in dit artikel een nieuw en kant-en-klaar model voorgesteld om celcommunicatie te bestuderen. De 3D-geprinte inserts zijn compatibel met alle adherente celtypen en maken het mogelijk om talloze combinaties van co-cultuur uit te voeren die gericht zijn op het dichter bij in vivo omstandigheden zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Indirecte celcommunicatie wordt vaak onderzocht met behulp van geconditioneerde media of co-cultuursysteemapparaten. Geconditioneerde mediavoorbereiding is stroomopwaarts in de experimenten tijdrovend en deze methode is beperkt tot eenzijdige effectanalyses. De vorige studie van Colin-Pierre et al.8 met behulp van geconditioneerde media werd uitgevoerd op de indirecte celcommunicatie tussen twee celtypen (HDMECs en KORS). De gegevens van deze eerdere studie toonden het effect aan van KORS…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd uitgevoerd in samenwerking met BASF Beauty Care Solutions. Mevrouw Charlie Colin-Pierre is een door BASF / CNRS gefinancierde PhD-fellow.
We willen de heer Mehdi Sellami bedanken voor het ontwerp van de 3D-geprinte inserts.
Materials
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
References
- Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer. Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Mesenchymal stem cell isolation from pulp tissue and co-culture with cancer cells to study their interactions. Journal of Visualized Experiments. (143), e58825 (2019).
- Lin, J., et al. Long non-coding RNA UBE2CP3 enhances HCC cell secretion of VEGFA and promotes angiogenesis by activating ERK1/2/HIF-1α/VEGFA signalling in hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 113 (2018).
- Soares, N. L., et al. Carbon monoxide modulation of microglia-neuron communication: Anti-neuroinflammatory and neurotrophic role. Molecular Neurobiology. 59 (2), 872-889 (2022).
- Al Halawani, A., Abdulkhalek, L., Mithieux, S. M., Weiss, A. S. Tropoelastin promotes the formation of dense, interconnected endothelial networks. Biomolecules. 11 (9), 1318 (2021).
- Mercatali, L., et al. Development of a human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes co-cultured with breast cancer cell lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
- Orona, N. S., Astort, F., Maglione, G. A., Yakisich, J. S., Tasat, D. R. Direct and indirect effect of air particles exposure induce Nrf2-dependent cardiomyocyte cellular response in vitro. Cardiovascular Toxicology. 19 (6), 575-587 (2019).
- Colin-Pierre, C., et al. The glypican-1/HGF/C-met and glypican-1/VEGF/VEGFR2 ternary complexes regulate hair follicle angiogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 781172 (2021).
- Toubal, A., et al. The NC1 domain of type XIX collagen inhibits melanoma cell migration. European Journal of Dermatology. 20 (6), 712-718 (2010).
- Wu, A. -. L., et al. Role of growth factors and internal limiting membrane constituents in müller cell migration. Experimental Eye Research. 202, 108352 (2021).
- Oudart, J. -. B., et al. Plasmin releases the anti-tumor peptide from the NC1 domain of collagen XIX. Oncotarget. 6 (6), 3656-3668 (2015).
- Martinotti, S., Ranzato, E. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. 2109, 225-229 (2020).
- Cattin, S., Ramont, L., Rüegg, C. Characterization and in vivo validation of a three-dimensional multi-cellular culture model to study heterotypic interactions in colorectal cancer cell growth, invasion and metastasis. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 97 (2018).
- Ma, Y. N., et al. Three-dimensional spheroid culture of adipose stromal vascular cells for studying adipogenesis in beef cattle. Animal. 12 (10), 2123-2129 (2018).
