Un innovador inserto impreso en 3D diseñado para permitir cultivos celulares sencillos en 2D y 3D
Summary
En este trabajo, se presenta un inserto impreso en 3D de nuevo diseño como modelo de cocultivo y se valida mediante el estudio de la comunicación intercelular paracrina entre las células endoteliales y los queratinocitos.
Abstract
Los análisis clásicos de la comunicación indirecta entre diferentes tipos de células requieren el uso de medios condicionados. Además, la producción de medios acondicionados sigue consumiendo mucho tiempo y está lejos de las condiciones fisiológicas y patológicas. Aunque algunos modelos de cocultivo están disponibles comercialmente, siguen estando restringidos a ensayos específicos y son principalmente para dos tipos de células.
En este caso, se utilizan insertos impresos en 3D que son compatibles con numerosos ensayos funcionales. El inserto permite la separación de un pocillo de una placa de 6 pocillos en cuatro compartimentos. Se puede configurar una amplia gama de combinaciones. Además, se han diseñado ventanas en cada pared de los compartimentos para que sea posible la comunicación intercelular potencial entre cada compartimento en el medio de cultivo de forma dependiente del volumen. Por ejemplo, la comunicación intercelular paracrina se puede estudiar entre cuatro tipos de células en monocapa, en 3D (esferoides) o combinando ambas. Además, se puede sembrar una mezcla de diferentes tipos de células en el mismo compartimento en formato 2D o 3D (organoides). La ausencia de fondo en los insertos impresos en 3D permite las condiciones habituales de cultivo en la placa, posible recubrimiento en la placa que contiene el inserto y visualización directa mediante microscopía óptica. Los múltiples compartimentos ofrecen la posibilidad de recoger diferentes tipos de células de forma independiente o de utilizar, en cada compartimento, diferentes reactivos para la extracción de ARN o proteínas. En este estudio, se proporciona una metodología detallada para utilizar el nuevo inserto impreso en 3D como sistema de co-cultivo. Para demostrar varias capacidades de este modelo flexible y simple, se realizaron ensayos funcionales de comunicación celular publicados anteriormente en los nuevos insertos impresos en 3D y se demostró que eran reproducibles. Los insertos impresos en 3D y el cultivo celular convencional con medios acondicionados condujeron a resultados similares. En conclusión, el inserto impreso en 3D es un dispositivo sencillo que se puede adaptar a numerosos modelos de cocultivos con tipos celulares adherentes.
Introduction
In vivo, las células se comunican entre sí directamente (contacto celular) o indirectamente (mediante la secreción de moléculas). Para estudiar la comunicación celular, se pueden desarrollar diferentes modelos de cocultivo, como el cocultivo directo (los diferentes tipos de células están en interacción directa en el mismo pocillo) y el cocultivo compartimentado (los diferentes tipos de células están en interacción indirecta en diferentes compartimentos de un sistema de cultivo)1. Además, los medios condicionados se pueden utilizar para sistemas de cocultivo, donde la interacción indirecta es posible gracias a las moléculas secretadas contenidas en el medio condicionado de un tipo de célula efectora que se transfiere a una célula respondedora tipo1.
En el caso de los estudios de comunicación celular paracrina, los sistemas de cocultivo indirecto proporcionan modelos que reflejan fuertemente las interacciones celulares in vivo. Se han desarrollado y comercializado sistemas de cocultivo indirecto, lo que ha permitido el establecimiento de modelos de cocultivo indirecto 2,3. Desafortunadamente, la mayoría de los sistemas de cocultivo indirecto proporcionan solo dos compartimentos. Otros sistemas de cocultivo indirecto proporcionan múltiples compartimentos, pero son menos escalables en comparación con el sistema reportado en el presente manuscrito. Algunos de ellos no permiten una visualización clásica bajo un microscopio, y a menudo presentan métodos de aplicación específicos. En varios estudios, la comunicación paracrina entre diferentes tipos celulares es probada por el modelo de medios condicionados 4,5,6,7. Esta es una forma más fácil de investigación en comparación con los sistemas de cocultivo indirectos, ya que no requiere que se establezcan métodos o materiales específicos1. Por otro lado, la preparación de medios acondicionados requiere mucho tiempo y proporciona información solo sobre la señalización celular unidireccional (efector a respondedor)1.
En este trabajo se propone una nueva y sencilla forma de investigar la comunicación celular. Al permitir la combinación de varios tipos de células en interacción directa o indirecta y en formatos 2D o 3D, los insertos impresos presentan numerosas ventajas para configurar fácilmente modelos de cocultivo. Adaptado para ser colocado en los pocillos de las placas de 6 pocillos, el inserto impreso en 3D es circular y permite la separación del pocillo en cuatro compartimentos (dos compartimentos grandes y dos compartimentos pequeños; Figura 1A). Las inserciones impresas en 3D se caracterizan por la ausencia de fondo. Por lo tanto, las células están en contacto directo con la placa sobre la que se coloca el inserto. Además, cada compartimento se puede revestir independientemente de los demás. Además, el comportamiento de la célula se puede seguir fácilmente bajo microscopios ópticos. La presencia de ventanas de comunicación en cada pared del inserto permite la adición, en el momento óptimo, de un medio común para realizar diferentes experimentos de co-cultivo. Se pueden realizar numerosas combinaciones de cocultivo para estudiar la comunicación directa y/o indirecta entre varios tipos de células. Por ejemplo, se puede diseñar un modelo de cocultivo indirecto entre cuatro tipos celulares diferentes en monocapa y/o en 3D (esferoides). También se puede realizar una combinación de modelos de cocultivo directo e indirecto mezclando diferentes tipos de células en el mismo compartimento. El efecto de estructuras complejas (organoides, explantes de tejidos, etc.) sobre diferentes tipos celulares podría ser otro ejemplo de modelos que se pueden realizar. Además, los insertos impresos en 3D son compatibles con ensayos funcionales de biología celular (proliferación, migración, formación de pseudotubos, diferenciación, etc.) y con pruebas bioquímicas (extracción de ADN, ARN, proteínas, lípidos, etc.). Por último, los insertos impresos en 3D proporcionan una amplia gama de esquemas experimentales de modelos de cocultivo con la posibilidad de combinar simultáneamente diferentes ensayos en el mismo experimento en los diferentes compartimentos.
Se presentan algunas capacidades de los insertos impresos en 3D para validarlos como un modelo de cocultivo rápido y fácil de usar. En comparación con un estudio publicado anteriormente realizado sobre la comunicación de células paracrinas, se demuestra la capacidad de los insertos impresos en 3D para ser un valioso modelo de cocultivo. Para evaluar este punto, se comparó la regulación de la proliferación y migración de células endoteliales por queratinocitos entre el sistema de insertos impresos en 3D y el sistema clásico que utiliza medios acondicionados. Los insertos impresos en 3D permiten obtener resultados similares rápidamente en comparación con el sistema convencional que utiliza medios acondicionados. De hecho, los insertos impresos en 3D proporcionan un modelo robusto para estudiar las interacciones celulares en ambas direcciones sin la necesidad de producir medios acondicionados y con la posibilidad de realizar en paralelo los ensayos de proliferación y migración en el mismo experimento.
Para concluir, en este trabajo se propone un modelo nuevo y listo para usar para estudiar la comunicación celular. Compatibles con todos los tipos de células adherentes, los insertos impresos en 3D permiten realizar numerosas combinaciones de cocultivo que tienen como objetivo acercarse más a las condiciones in vivo .
Protocol
Representative Results
Discussion
La comunicación celular indirecta se investiga comúnmente utilizando medios condicionados o dispositivos de sistemas de cocultivo. La preparación de medios acondicionados requiere mucho tiempo en la fase inicial de los experimentos, y este método se limita a análisis de efectos unilaterales. El estudio previo de Colin-Pierre et al.8 utilizando medios condicionados se llevó a cabo en la comunicación celular indirecta entre dos tipos de células (HDMECs y KORS). Los datos de este est…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio se realizó en colaboración con BASF Beauty Care Solutions. La Sra. Charlie Colin-Pierre es becaria de doctorado financiada por BASF / CNRS.
Deseamos agradecer al Sr. Mehdi Sellami por la concepción de los insertos impresos en 3D.
Materials
| Autoclave | Getinge | APHP | Solid cycle, 121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | Impression performed by 3D-Morphoz company (Reims, France) |
| Cell culture detergents | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| Counting slide | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| Endothelial cell medium | ScienCell | 1001 | Basal medium +/- 25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of endothelial cell growth supplement (ECGS, 1052), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503). |
| EVE Automated cell counter | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10x of magnification |
| Food silicon reagent and catalyst kit | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B printer | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | Impression performed by 3D-Morphoz company |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS ) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | Software used for the measurement of the uncovered surface (for migration assays) | |
| Mesenchymal stem cell medium | ScienCell | 7501 | Basal medium +/-25 mL of fetal bovine serum (FBS, 0025), 5 mL of mesenchymal stem cell growth supplement (MSCGS, 7552), and 5 mL of penicillin/streptomycin solution (P/S, 0503) |
| Microplate reader SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH software | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Without Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain | NanoEnTek | EBT-001 | |
| Trypsin / EDTA | Promocell | C-41020 | Incubation of KORS at 37 °C with 5% CO2 for 5 min. Incubation of HDMECs for 5 min at room temperature |
| 96-well plate Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
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