Summary

Intravitale beeldvorming van fluorescerende eiwitexpressie bij muizen met een gesloten schedel traumatisch hersenletsel en schedelvenster met behulp van een microscoop met twee fotonen

Published: April 21, 2023
doi:

Summary

Deze studie demonstreert de toediening van een repetitief traumatisch hersenletsel aan muizen en gelijktijdige implantatie van een schedelvenster voor daaropvolgende intravitale beeldvorming van een tot expressie gebracht neuron EGFP met behulp van twee-fotonmicroscopie.

Abstract

Het doel van dit protocol is om te demonstreren hoe de expressie en lokalisatie van een eiwit van belang in specifieke celtypen van de hersenen van een dier longitudinaal kan worden gevisualiseerd, bij blootstelling aan exogene stimuli. Hier wordt de toediening van een traumatisch hersenletsel (TBI) met gesloten schedel en gelijktijdige implantatie van een schedelvenster voor daaropvolgende longitudinale intravitale beeldvorming bij muizen getoond. Muizen worden intracraniaal geïnjecteerd met een adeno-geassocieerd virus (AAV) dat versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP) tot expressie brengt onder een neuronale specifieke promotor. Na 2 tot 4 weken worden de muizen onderworpen aan een repetitieve TBI met behulp van een gewichtsdruppelapparaat boven de AAV-injectielocatie. Binnen dezelfde chirurgische sessie worden de muizen geïmplanteerd met een metalen hoofdpost en vervolgens een glazen schedelvenster over de TBI-impactplaats. De expressie en cellulaire lokalisatie van EGFP wordt onderzocht met behulp van een microscoop met twee fotonen in hetzelfde hersengebied dat in de loop van maanden aan trauma is blootgesteld.

Introduction

Traumatisch hersenletsel (TBI), dat het gevolg kan zijn van sportblessures, botsingen met voertuigen en militaire gevechten, is een wereldwijd gezondheidsprobleem. TBI kan leiden tot fysiologische, cognitieve en gedragsstoornissen en levenslange invaliditeit of mortaliteit 1,2. De ernst van TBI kan worden geclassificeerd als mild, matig en ernstig, waarbij de overgrote meerderheid milde TBI is (75%-90%)3. Het wordt steeds meer erkend dat TBI, met name herhaalde voorvallen van TBI, neuronale degeneratie kan bevorderen en als risicofactoren kan dienen voor verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD), amyotrofische laterale sclerose (ALS), frontotemporale dementie (FTD) en chronische traumatische encefalopathie (CTE)4,5,6. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan TBI-geïnduceerde neurodegeneratie blijven echter onduidelijk en vormen dus een actief studiegebied. Om inzicht te krijgen in hoe neuronen reageren op en herstellen van TBI, wordt hierin een methode beschreven voor het monitoren van fluorescerend gelabelde eiwitten die van belang zijn, met name in neuronen, door middel van longitudinale intravitale beeldvorming bij muizen na TBI.

Daartoe laat deze studie zien hoe een chirurgische ingreep voor de toediening van gesloten schedel-TBI die vergelijkbaar is met wat eerder is gerapporteerd7,8 kan worden gecombineerd met een chirurgische ingreep voor implantatie van een schedelvenster voor stroomafwaartse intravitale beeldvorming, zoals beschreven door Goldey et al9. Het is met name niet haalbaar om eerst een schedelraam te implanteren en vervolgens een TBI in dezelfde regio uit te voeren, omdat de impact van de gewichtsval die de TBI induceert het venster waarschijnlijk zal beschadigen en onherstelbare schade aan de muis zal toebrengen. Daarom is dit protocol ontworpen om de TBI toe te dienen en vervolgens het schedelvenster direct boven de impactplaats te implanteren, allemaal binnen dezelfde chirurgische sessie. Een voordeel van het combineren van zowel de TBI als de schedelvensterimplantatie in één operatiesessie is een vermindering van het aantal keren dat een muis wordt geopereerd. Verder stelt het iemand in staat om de onmiddellijke respons (d.w.z. op de tijdschaal van uren) op TBI te volgen, in tegenstelling tot het implanteren van het venster bij een latere chirurgische sessie (d.w.z. de eerste beeldvorming die begint op een tijdschaal van dagen na TBI). Het craniale venster en het intravitale beeldvormingsplatform bieden ook voordelen ten opzichte van het monitoren van neuronale eiwitten met conventionele methoden, zoals immunokleuring van vaste weefsels. Er zijn bijvoorbeeld minder muizen nodig voor intravitale beeldvorming, omdat dezelfde muis op meerdere tijdstippen kan worden bestudeerd, in tegenstelling tot afzonderlijke cohorten muizen die nodig zijn voor discrete tijdstippen. Verder kunnen dezelfde neuronen in de loop van de tijd worden gevolgd, waardoor men specifieke biologische of pathologische gebeurtenissen binnen dezelfde cel kan volgen.

Als proof of concept wordt hier de neuronspecifieke expressie van versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP) onder de synapsinepromotor gedemonstreerd10. Deze benadering kan worden uitgebreid tot 1) verschillende hersenceltypen door gebruik te maken van andere celtypespecifieke promotors, zoals myeline-basisproteïne (MBP)-promotor voor oligodendrocyten en glia-fibrillair zuur eiwit (GFAP)-promotor voor astrocyten11, 2) verschillende doeleiwitten van belang door hun genen te fuseren met het EGFP-gen, en 3) meerdere eiwitten tot co-expressie te brengen die zijn gefuseerd met verschillende fluoroforen. Hier wordt EGFP verpakt en tot expressie gebracht via adeno-geassocieerd virus (AAV) toediening via een intracraniële injectie. Een TBI met gesloten schedel wordt toegediend met behulp van een apparaat voor gewichtsval, gevolgd door implantatie van een schedelvenster. Visualisatie van neuronale EGFP wordt bereikt door het craniale venster, met behulp van twee-fotonmicroscopie om EGFP-fluorescentie in vivo te detecteren. Met de twee-fotonlaser is het mogelijk om dieper in het corticale weefsel door te dringen met minimale fotoschade, waardoor herhaalde longitudinale beeldvorming van dezelfde corticale regio’s binnen een individuele muis gedurende dagen en tot maanden mogelijk is12,13,14,15. Kortom, deze benadering van het combineren van een TBI-operatie met intravitale beeldvorming heeft tot doel het begrip van de moleculaire gebeurtenissen die bijdragen aan TBI-geïnduceerde ziektepathologie te vergroten16,17.

Protocol

Alle diergerelateerde protocollen zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, gepubliceerd door de commissie van de National Research Council (VS). De protocollen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Chan Medical School (UMMS) van de Universiteit van Massachusetts (vergunningsnummer 202100057). In het kort, zoals te zien is in het schema van de studie (figuur 1), krijgt het dier een virusinjectie, ee…

Representative Results

Als proof of concept voor dit protocol werden virale deeltjes die AAV-Syn1-EGFP tot expressie brengen, geïnjecteerd in de hersenschors van mannelijke TDP-43 Q331K/Q331K-muizen (C57BL/6J-achtergrond)19 op de leeftijd van 3 maanden. Opgemerkt wordt dat wildtype C57BL/6J-dieren ook kunnen worden gebruikt, maar deze studie werd uitgevoerd bij TDP-43 Q331K/Q331K-muizen omdat het laboratorium zich richt op onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten. 4 weken na de AAV-injectie werd …

Discussion

In deze studie werden AAV-injectie, TBI-toediening en een hoofdpost met schedelvensterimplantatie gecombineerd voor longitudinale beeldvormingsanalyse van EGFP-gelabelde neuronen in de hersenschors van muizen (lagen IV en V) om de effecten van TBI op corticale neuronen te observeren. Deze studie merkt op dat de TBI-locatie die hier is gekozen, boven de hippocampus, een relatief vlak en breed oppervlak biedt voor implantatie van het schedelvenster. Omgekeerd is de schedel relatief smal aan de voorkant van deze plaats, en …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken Dr. Miguel Sena-Esteves van de Chan Medical School van de Universiteit van Massachusetts voor het schenken van het AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP-virus, en Debra Cameron van de Chan Medical School van de Universiteit van Massachusetts voor het tekenen van de schedelschets van de muizen. We danken ook de huidige en voormalige leden van de Bosco-, Schafer- en Henninger-labs voor hun suggesties en steun. Dit werk werd gefinancierd door het ministerie van Defensie (W81XWH202071/PRARP) aan DAB, DS en NH.

Materials

Adjustable Precision Applicator Brushes Parkell S379
BD insulin syringe BD NDC/HRI#08290-3284-38 5/16" x 31G
Betadine Purdue NDC67618-151-17 including 7.5% povidone iodine
Buprenorphine PAR Pharmaceutical NDC 42023-179-05
Cefazolin HIKMA Pharmaceutical NDC 0143-9924-90
Ceramic Mixing Dish Parkell SKU: S387 For dental cement preparation
Cotton Tipped Applicators ZORO catlog #: G9531702
Catalyst Parkell S371 full name: "C" Universal TBB Catalyst
Dental cement powder Parkell S396 Radiopaque L-Powder for C&B Metabond
Dental drill Foredom H.MH-130
Dental drill controller Foredom HP4-310
Dexamethasone Phoenix NDC 57319-519-05
EF4 carbide bit Microcopy Lot# C150113 Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2
Ethonal Fisher Scientific 04355223EA 75%
FG1/4 carbide bit Microcopy Lot# C150413 Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4
FG4 carbide bit Microcopy Lot# C150309 Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1
Headpost N/A N/A Custom-manufactured
Heating apparatus CWE TC-1000 Mouse equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery
Heating blanket CVS pharmacy E12107 extra heating device and be used after surgery
Isoflurane Pivetal NDC 46066-755-03
Isoflurane induction chamber Vetequip 89012-688 induction chamber for short
Isoflurane volatilizing machine Vetequip 911103
Isoflurane volatilizing machine holder Vetequip 901801
Leica surgical microscope Leica LEICA 10450243
Lubricant ophthalmic ointment Picetal NDC 46066-753-55
Marker pen Delasco SMP-BK
Meloxicam Norbrook NDC 55529-040-10
Microinjection pump and its controller World Precision Instruments micro4 and UMP3
Microliter syringe Hamilton Hamilton 80014 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3
Mosquito forceps CAROLINA Item #:625314 Stainless Steel, Curved, 5 in
Depilatory agent McKesson Corporation N/A Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion
Microscope 1 Nikon SMZ745 Nikon microscope for cranial window preparation
Microscope 2 Zeiss LSM 7 MP two-photon microscope
Multiphoton laser Coherent Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W laser for two-photon microscopy
Non-absorbable surgical suture Harvard Apparatus catlog# 59-6860 6-0, with round needle
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA 81
No-Snag Needle Holder CAROLINA Item #: 567912
Quick base liquid Parkell S398 "B" Quick Base For C&B Metabond
Regular scissor 1 Eurostat eurostat es5-300
Regular scissor 2 World Precision Instruments No. 501759-G
Round cover glass 1 Warner instruments CS-5R Cat# 64-0700 for 5 mm of diameter
Round cover glass 2 Warner instruments CS-3R Cat# 64-0720 for 3 mm of diameter
Rubber rings Orings-Online Item # OO-014-70-50 O-Rings
Saline Bioworld L19102411PR
Spring scissor 1 World Precision Instruments No. 91500-09 tip straight
Spring scissor 2 World Precision Instruments No. 91501-09 tip curved
Stereotaxic platform KOPF Model 900LS
Super glue Henkel Item #: 1647358
surgical Caliper World Precision Instruments No. 501200
Surgical forceps 1 ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES Catlog# 0508-5/45-PO style 5/45, curved
Surgical forceps 2 ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES catlog# 0103-5-PO style 5, straight
Surgical forceps 3 ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES catlog# 72912
Surgical forceps 4 ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES Catlog# 0508-5/45-PO style 5/45, curved
Surgical gauze ZORO catlog #: G0593801
Surgical lamp Leica Leica KL300 LED
UV box Spectrolinker XL-1000 also called UV crosslinker
Vaporguard Vetequip 931401
Vetbond Tissue Adhesive 3M Animal Care Part Number:014006

References

  1. Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).
  2. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. . Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , (2022).
  3. Xu, X., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60 (2021).
  4. Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
  5. Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).
  6. McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).
  7. Henninger, N., et al. Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1. Brain. 139, 1094-1105 (2016).
  8. Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).
  9. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
  10. Kugler, S., et al. Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors. Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).
  11. von Jonquieres, G., et al. Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 8 (6), 65646 (2013).
  12. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
  13. Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
  14. Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice. Biomaterials. 276, 121060 (2021).
  15. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).
  16. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
  17. Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
  18. Mondo, E., et al. A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature. The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).
  19. White, M. A., et al. TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD. Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).
  20. Chou, A., et al. Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).
  21. Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice. Journal of Visualized Experiments. (172), e62633 (2021).
  22. Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
  23. Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
  24. Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
  25. Li, D., et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight. 2 (1), 1-18 (2022).
  26. Paveliev, M., et al. Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51559 (2014).
  27. Han, X., et al. In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 210 (2020).
  28. Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report. Medicine. 99 (32), 21601 (2020).
  29. Courville, C. B. The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations. Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).
  30. Drew, L. B., Drew, W. E. The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury. Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).

Play Video

Cite This Article
Zhong, J., Gunner, G., Henninger, N., Schafer, D. P., Bosco, D. A. Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope. J. Vis. Exp. (194), e64701, doi:10.3791/64701 (2023).

View Video