Intravitale Bildgebung der fluoreszierenden Proteinexpression bei Mäusen mit Schädel-Hirn-Trauma und Schädelfenster mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop
Summary
Diese Studie zeigt die Verabreichung eines wiederholten Schädel-Hirn-Traumas an Mäuse und die gleichzeitige Implantation eines kranialen Fensters für die anschließende intravitale Bildgebung eines neuronenexprimierten EGFP mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie.
Abstract
Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie die Expression und Lokalisierung eines interessierenden Proteins in bestimmten Zelltypen des Gehirns eines Tieres bei Exposition gegenüber exogenen Stimuli longitudinal visualisiert werden kann. Hier wird die Verabreichung eines Schädel-Hirn-Traumas (SHT) und die gleichzeitige Implantation eines Schädelfensters für die anschließende longitudinale intravitale Bildgebung bei Mäusen gezeigt. Mäusen wird intrakranial ein Adeno-assoziiertes Virus (AAV) injiziert, das ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein (EGFP) unter einem neuronalen spezifischen Promotor exprimiert. Nach 2 bis 4 Wochen werden die Mäuse einem wiederholten Schädel-Hirn-Trauma mit einem Gewichtsabwurfgerät über der AAV-Injektionsstelle unterzogen. In derselben chirurgischen Sitzung werden den Mäusen ein Kopfpfosten aus Metall und dann ein Schädelfenster aus Glas über der SHT-Aufprallstelle implantiert. Die Expression und zelluläre Lokalisation von EGFP wird mit einem Zwei-Photonen-Mikroskop in derselben Hirnregion untersucht, die über Monate hinweg traumatisiert wurde.
Introduction
Schädel-Hirn-Traumata (SHT), die durch Sportverletzungen, Fahrzeugkollisionen und militärische Kämpfe entstehen können, sind ein weltweites Gesundheitsproblem. SHT kann zu physiologischen, kognitiven und Verhaltensdefiziten sowie zu lebenslanger Behinderung oder Mortalität führen 1,2. Der Schweregrad des Schädel-Hirn-Traumas kann als leicht, mittelschwer und schwer klassifiziert werden, wobei die überwiegende Mehrheit ein leichtes SHT ist (75 %-90 %)3. Es wird zunehmend anerkannt, dass SHT, insbesondere das wiederholte Auftreten von SHT, die neuronale Degeneration fördern und als Risikofaktoren für verschiedene neurodegenerative Erkrankungen dienen kann, darunter Alzheimer (AD), amyotrophe Lateralsklerose (ALS), frontotemporale Demenz (FTD) und chronische traumatische Enzephalopathie (CTE)4,5,6. Die molekularen Mechanismen, die der SHT-induzierten Neurodegeneration zugrunde liegen, sind jedoch noch unklar und stellen daher ein aktives Forschungsgebiet dar. Um einen Einblick in die Art und Weise zu gewinnen, wie Neuronen auf SHT reagieren und sich davon erholen, wird hierin ein Verfahren zur Überwachung fluoreszenzmarkierter Proteine von Interesse, insbesondere innerhalb von Neuronen, durch longitudinale intravitale Bildgebung bei Mäusen nach einem SHT beschrieben.
Zu diesem Zweck wird in dieser Studie gezeigt, wie ein chirurgisches Verfahren zur Verabreichung eines Schädel-Hirn-SHT kombiniert werden kann, das dem ähnelt, was zuvor berichtet wurde7,8, zusammen mit einem chirurgischen Verfahren zur Implantation eines kranialen Fensters für die nachgeschaltete intravitale Bildgebung, wie von Goldey et al.beschrieben 9. Insbesondere ist es nicht möglich, zuerst ein Schädelfenster zu implantieren und anschließend ein Schädel-Hirn-Trauma in derselben Region durchzuführen, da der Aufprall des Gewichtsverlusts, der das Schädel-Hirn-Trauma auslöst, wahrscheinlich das Fenster beschädigt und der Maus irreparable Schäden zufügt. Daher wurde dieses Protokoll entwickelt, um das SHT zu verabreichen und dann das Schädelfenster direkt über der Aufprallstelle zu implantieren, und das alles innerhalb derselben chirurgischen Sitzung. Ein Vorteil der Kombination von SHT und Schädelfensterimplantation in einer einzigen chirurgischen Sitzung ist die Verringerung der Anzahl der Operationen, mit denen eine Maus operiert wird. Darüber hinaus ermöglicht es die unmittelbare Reaktion (d. h. auf der Zeitskala von Stunden) auf ein SHT, im Gegensatz zur Implantation des Fensters bei einer späteren chirurgischen Sitzung (d. h. die erste Bildgebung beginnt auf einer Zeitskala von Tagen nach dem SHT). Das kraniale Fenster und die intravitale Bildgebungsplattform bieten auch Vorteile gegenüber der Überwachung neuronaler Proteine mit herkömmlichen Methoden wie der Immunfärbung von fixiertem Gewebe. Zum Beispiel werden weniger Mäuse für die intravitale Bildgebung benötigt, da dieselbe Maus zu mehreren Zeitpunkten untersucht werden kann, im Gegensatz zu separaten Kohorten von Mäusen, die für diskrete Zeitpunkte benötigt werden. Darüber hinaus können dieselben Neuronen im Laufe der Zeit überwacht werden, so dass bestimmte biologische oder pathologische Ereignisse innerhalb derselben Zelle verfolgt werden können.
Als Proof of Concept wird hier die neuronenspezifische Expression des verstärkten grün fluoreszierenden Proteins (EGFP) unter dem Synapsin-Promotor demonstriert10. Dieser Ansatz kann auf 1) verschiedene Gehirnzelltypen ausgeweitet werden, indem andere zelltypspezifische Promotoren verwendet werden, wie z. B. Myelin-Basisprotein (MBP)-Promotor für Oligodendrozyten und Gliafibrillen-Säureprotein (GFAP)-Promotor für Astrozyten11, 2) verschiedene Zielproteine von Interesse, indem ihre Gene mit dem EGFP-Gen fusioniert werden, und 3) mehrere Proteine co-exprimieren, die mit verschiedenen Fluorophoren fusioniert sind. Hier wird EGFP verpackt und über das Adeno-assoziierte Virus (AAV) durch eine intrakranielle Injektion exprimiert. Ein Schädel-Hirn-Trauma wird mit einem Gewichtsabfallgerät verabreicht, gefolgt von der Implantation eines Schädelfensters. Die Visualisierung der neuronalen EGFP erfolgt durch das kraniale Fenster, wobei die Zwei-Photonen-Mikroskopie verwendet wird, um die EGFP-Fluoreszenz in vivo zu detektieren. Mit dem Zwei-Photonen-Laser ist es möglich, mit minimaler Photoschädigung tiefer in das kortikale Gewebe einzudringen, was eine wiederholte Längsbildgebung derselben kortikalen Regionen innerhalb einer einzelnen Maus über Tage und bis zu Monate ermöglicht12,13,14,15. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieser Ansatz, eine SHT-Operation mit intravitaler Bildgebung zu kombinieren, darauf abzielt, das Verständnis der molekularen Ereignisse zu verbessern, die zur SHT-induzierten Krankheitspathologie beitragen16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie wurden AAV-Injektion, SHT-Verabreichung und ein Headpost mit kranialer Fensterimplantation für die longitudinale Bildgebungsanalyse von EGFP-markierten Neuronen innerhalb des Hirnkortex der Maus (Schichten IV und V) kombiniert, um die Auswirkungen von SHT auf kortikale Neuronen zu beobachten. Diese Studie stellt fest, dass die hier gewählte SHT-Stelle, oberhalb des Hippocampus, eine relativ flache und breite Oberfläche für die Implantation des Schädelfensters bietet. Umgekehrt ist der Schädel vor d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Miguel Sena-Esteves von der University of Massachusetts Chan Medical School für das Geschenk des AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP-Virus und Debra Cameron von der University of Massachusetts Chan Medical School für das Zeichnen der Mausschädelskizze. Wir danken auch aktuellen und ehemaligen Mitgliedern der Labore Bosco, Schäfer und Henninger für ihre Vorschläge und Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom Verteidigungsministerium (W81XWH202071/PRARP) für DAB, DS und NH finanziert.
Materials
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
References
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