Imaging intravitale dell'espressione di proteine fluorescenti nei topi con una lesione cerebrale traumatica a cranio chiuso e una finestra cranica utilizzando un microscopio a due fotoni
Summary
Questo studio dimostra la somministrazione di una lesione cerebrale traumatica ripetitiva ai topi e l’impianto simultaneo di una finestra cranica per il successivo imaging intravitale di un EGFP espresso da neuroni utilizzando la microscopia a due fotoni.
Abstract
L’obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare come visualizzare longitudinalmente l’espressione e la localizzazione di una proteina di interesse all’interno di specifici tipi di cellule del cervello di un animale, in seguito all’esposizione a stimoli esogeni. Qui, viene mostrata la somministrazione di una lesione cerebrale traumatica a cranio chiuso (TBI) e l’impianto simultaneo di una finestra cranica per il successivo imaging intravitale longitudinale nei topi. Ai topi viene iniettato per via intracranica un virus adeno-associato (AAV) che esprime una proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) sotto un promotore neuronale specifico. Dopo 2-4 settimane, i topi vengono sottoposti a un trauma cranico ripetitivo utilizzando un dispositivo di caduta del peso sopra la posizione di iniezione dell’AAV. All’interno della stessa sessione chirurgica, ai topi viene impiantato un palo di metallo e quindi una finestra cranica di vetro sopra il sito di impatto del trauma cranico. L’espressione e la localizzazione cellulare dell’EGFP vengono esaminate utilizzando un microscopio a due fotoni nella stessa regione del cervello esposta a traumi nel corso di mesi.
Introduction
La lesione cerebrale traumatica (TBI), che può derivare da lesioni sportive, collisioni di veicoli e combattimenti militari, è un problema di salute in tutto il mondo. Il trauma cranico può portare a deficit fisiologici, cognitivi e comportamentali e disabilità o mortalità permanente 1,2. La gravità del trauma cranico può essere classificata come lieve, moderata e grave, la stragrande maggioranza dei quali è un trauma cranico lieve (75%-90%)3. È sempre più riconosciuto che il trauma cranico, in particolare le occorrenze ripetitive di trauma cranico, possono promuovere la degenerazione neuronale e fungere da fattori di rischio per diverse malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (AD), la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), la demenza frontotemporale (FTD) e l’encefalopatia traumatica cronica (CTE)4,5,6. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base della neurodegenerazione indotta da TBI rimangono poco chiari e rappresentano quindi un’area di studio attiva. Per ottenere informazioni su come i neuroni rispondono e si riprendono dal trauma cranico, viene descritto un metodo per il monitoraggio delle proteine di interesse marcate con fluorescenza, in particolare all’interno dei neuroni, mediante imaging intravitale longitudinale nei topi dopo trauma cranico.
A tal fine, questo studio mostra come combinare una procedura chirurgica per la somministrazione di un trauma cranico a cranio chiuso simile a quella precedentemente riportata7,8, insieme a una procedura chirurgica per l’impianto di una finestra cranica per l’imaging intravitale a valle, come descritto da Goldey et al9. In particolare, non è possibile impiantare prima una finestra cranica e successivamente eseguire un trauma cranico nella stessa regione, poiché l’impatto della caduta di peso che induce il trauma cranico rischia di danneggiare la finestra e causare danni irreparabili al topo. Pertanto, questo protocollo è stato progettato per somministrare il trauma cranico e quindi impiantare la finestra cranica direttamente sul sito di impatto, il tutto all’interno della stessa sessione chirurgica. Un vantaggio della combinazione del trauma cranico e dell’impianto della finestra cranica in un’unica sessione chirurgica è la riduzione del numero di volte in cui un topo viene sottoposto a intervento chirurgico. Inoltre, consente di monitorare la risposta immediata (cioè sulla scala temporale di ore) al trauma cranico, invece di impiantare la finestra in una sessione chirurgica successiva (cioè l’imaging iniziale che inizia su una scala temporale di giorni dopo il trauma cranico). La finestra cranica e la piattaforma di imaging intravitale offrono anche vantaggi rispetto al monitoraggio delle proteine neuronali con metodi convenzionali come l’immunocolorazione dei tessuti fissi. Ad esempio, sono necessari meno topi per l’imaging intravitale, poiché lo stesso topo può essere studiato in più punti temporali, al contrario di coorti separate di topi necessarie per punti temporali discreti. Inoltre, gli stessi neuroni possono essere monitorati nel tempo, consentendo di tracciare specifici eventi biologici o patologici all’interno della stessa cellula.
Come prova di concetto, l’espressione neurone-specifica della proteina fluorescente verde potenziata (EGFP) sotto il promotore della sinapsina è dimostrata qui10. Questo approccio può essere esteso a 1) diversi tipi di cellule cerebrali utilizzando altri promotori specifici del tipo di cellula, come il promotore della proteina basica della mielina (MBP) per gli oligodendrociti e il promotore della proteina acida fibrillare gliale (GFAP) per gli astrociti11, 2) diverse proteine bersaglio di interesse fondendo i loro geni con il gene EGFP e 3) co-esprimendo più proteine fuse a diversi fluorofori. In questo caso, l’EGFP viene confezionato ed espresso tramite la somministrazione di virus adeno-associati (AAV) attraverso un’iniezione intracranica. Un trauma cranico a cranio chiuso viene somministrato utilizzando un dispositivo per la riduzione del peso, seguito dall’impianto di una finestra cranica. La visualizzazione dell’EGFP neuronale si ottiene attraverso la finestra cranica, utilizzando la microscopia a due fotoni per rilevare la fluorescenza dell’EGFP in vivo. Con il laser a due fotoni, è possibile penetrare più in profondità nel tessuto corticale con un fotodanno minimo, consentendo l’imaging longitudinale ripetuto delle stesse regioni corticali all’interno di un singolo topo per giorni e fino a mesi12,13,14,15. In sintesi, questo approccio di combinazione di un intervento chirurgico per trauma cranico con l’imaging intravitale mira a far progredire la comprensione degli eventi molecolari che contribuiscono alla patologia della malattia indotta da trauma cranico16,17.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, l’iniezione di AAV, la somministrazione di TBI e un copricapo con impianto di finestra cranica sono stati combinati per l’analisi di imaging longitudinale dei neuroni marcati con EGFP all’interno della corteccia cerebrale del topo (strati IV e V) per osservare gli effetti del TBI sui neuroni corticali. Questo studio rileva che il sito del trauma cranico scelto qui, sopra l’ippocampo, fornisce una superficie relativamente piatta e ampia per l’impianto della finestra cranica. Al contrario, il cranio è re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Miguel Sena-Esteves della Chan Medical School dell’Università del Massachusetts per aver donato il virus AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP, e Debra Cameron della University of Massachusetts Chan Medical School per aver disegnato lo schizzo del cranio dei topi. Ringraziamo anche i membri attuali e passati dei laboratori Bosco, Schafer e Henninger per i loro suggerimenti e il loro supporto. Questo lavoro è stato finanziato dal Dipartimento della Difesa (W81XWH202071/PRARP) a DAB, DS e NH.
Materials
| Adjustable Precision Applicator Brushes | Parkell | S379 | |
| BD insulin syringe | BD | NDC/HRI#08290-3284-38 | 5/16" x 31G |
| Betadine | Purdue | NDC67618-151-17 | including 7.5% povidone iodine |
| Buprenorphine | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| Cefazolin | HIKMA Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Ceramic Mixing Dish | Parkell | SKU: S387 | For dental cement preparation |
| Cotton Tipped Applicators | ZORO | catlog #: G9531702 | |
| Catalyst | Parkell | S371 | full name: "C" Universal TBB Catalyst |
| Dental cement powder | Parkell | S396 | Radiopaque L-Powder for C&B Metabond |
| Dental drill | Foredom | H.MH-130 | |
| Dental drill controller | Foredom | HP4-310 | |
| Dexamethasone | Phoenix | NDC 57319-519-05 | |
| EF4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150113 | Head Dia/Lgth/mm 1.0/4.2 |
| Ethonal | Fisher Scientific | 04355223EA | 75% |
| FG1/4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150413 | Head Dia/Lgth/mm 0.5/0.4 |
| FG4 carbide bit | Microcopy | Lot# C150309 | Head Dia/Lgth/mm 1.4/1.1 |
| Headpost | N/A | N/A | Custom-manufactured |
| Heating apparatus | CWE | TC-1000 Mouse | equiped with the stereotaxic instrument and be used while operating surgery |
| Heating blanket | CVS pharmacy | E12107 | extra heating device and be used after surgery |
| Isoflurane | Pivetal | NDC 46066-755-03 | |
| Isoflurane induction chamber | Vetequip | 89012-688 | induction chamber for short |
| Isoflurane volatilizing machine | Vetequip | 911103 | |
| Isoflurane volatilizing machine holder | Vetequip | 901801 | |
| Leica surgical microscope | Leica | LEICA 10450243 | |
| Lubricant ophthalmic ointment | Picetal | NDC 46066-753-55 | |
| Marker pen | Delasco | SMP-BK | |
| Meloxicam | Norbrook | NDC 55529-040-10 | |
| Microinjection pump and its controller | World Precision Instruments | micro4 and UMP3 | |
| Microliter syringe | Hamilton | Hamilton 80014 | 1701 RN, 10 μL gauge for syringe and 32 gauge for needle, 2 in, point style 3 |
| Mosquito forceps | CAROLINA | Item #:625314 | Stainless Steel, Curved, 5 in |
| Depilatory agent | McKesson Corporation | N/A | Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion |
| Microscope 1 | Nikon | SMZ745 | Nikon microscope for cranial window preparation |
| Microscope 2 | Zeiss | LSM 7 MP | two-photon microscope |
| Multiphoton laser | Coherent | Chameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18W | laser for two-photon microscopy |
| Non-absorbable surgical suture | Harvard Apparatus | catlog# 59-6860 | 6-0, with round needle |
| Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA 81 | |
| No-Snag Needle Holder | CAROLINA | Item #: 567912 | |
| Quick base liquid | Parkell | S398 | "B" Quick Base For C&B Metabond |
| Regular scissor 1 | Eurostat | eurostat es5-300 | |
| Regular scissor 2 | World Precision Instruments | No. 501759-G | |
| Round cover glass 1 | Warner instruments | CS-5R Cat# 64-0700 | for 5 mm of diameter |
| Round cover glass 2 | Warner instruments | CS-3R Cat# 64-0720 | for 3 mm of diameter |
| Rubber rings | Orings-Online | Item # OO-014-70-50 | O-Rings |
| Saline | Bioworld | L19102411PR | |
| Spring scissor 1 | World Precision Instruments | No. 91500-09 | tip straight |
| Spring scissor 2 | World Precision Instruments | No. 91501-09 | tip curved |
| Stereotaxic platform | KOPF | Model 900LS | |
| Super glue | Henkel | Item #: 1647358 | |
| surgical Caliper | World Precision Instruments | No. 501200 | |
| Surgical forceps 1 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical forceps 2 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 0103-5-PO | style 5, straight |
| Surgical forceps 3 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | catlog# 72912 | |
| Surgical forceps 4 | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | Catlog# 0508-5/45-PO | style 5/45, curved |
| Surgical gauze | ZORO | catlog #: G0593801 | |
| Surgical lamp | Leica | Leica KL300 LED | |
| UV box | Spectrolinker | XL-1000 | also called UV crosslinker |
| Vaporguard | Vetequip | 931401 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M Animal Care | Part Number:014006 |
References
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