एक पाल्मिटिक एसिड-प्रेरित इन विट्रो मॉडल में गैर-अल्कोहल फैटी लीवर रोग पर प्लाटिकोडिन डी के सुरक्षात्मक प्रभावों की जांच
Summary
यह प्रोटोकॉल एक पामिटिक एसिड-प्रेरित इन विट्रो मॉडल में गैर-मादक फैटी यकृत रोग पर प्लैटिकोडिन डी के सुरक्षात्मक प्रभावों की जांच करता है।
Abstract
गैर-अल्कोहल फैटी लीवर रोग (एनएएफएलडी) की घटना दुनिया भर में खतरनाक दर से बढ़ रही है। प्लाटीकोडन ग्रैंडिफ्लोरम का व्यापक रूप से विभिन्न बीमारियों के उपचार के लिए एक पारंपरिक नृवंशविज्ञान के रूप में उपयोग किया जाता है और यह एक विशिष्ट कार्यात्मक भोजन है जिसे रोजमर्रा के आहार में शामिल किया जा सकता है। अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि प्लाटीकोडन ग्रैंडिफ्लोरम में मुख्य सक्रिय अवयवों में से एक प्लैटिकोडिन डी (पीडी) में उच्च जैव उपलब्धता है और एनएएफएलडी की प्रगति को काफी कम करता है, लेकिन इसका अंतर्निहित तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं है। इस अध्ययन का उद्देश्य विट्रो में एनएएफएलडी के खिलाफ पीडी के चिकित्सीय प्रभाव की जांच करना है। एएमएल -12 कोशिकाओं को विट्रो में एनएएफएलडी मॉडल करने के लिए 24 घंटे के लिए 300 एसएम पामिटिक एसिड (पीए) के साथ इलाज किया गया था। फिर, कोशिकाओं को या तो पीडी के साथ इलाज किया गया था या 24 घंटे के लिए कोई पीडी उपचार नहीं मिला था। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के स्तर का विश्लेषण 2′,7′-डाइक्लोरो-डाइहाइड्रो-फ्लोरेसिन डायसेटेट (डीसीएफएच-डीए) धुंधला करके किया गया था, और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता जेसी -1 धुंधला विधि द्वारा निर्धारित की गई थी। इसके अलावा, सेल लाइसेट में एलसी 3-II / एलसी 3-आई और पी 62 / एसक्यूएसटीएम 1 के प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर का विश्लेषण पश्चिमी सोख्ता द्वारा किया गया था। पीडी को नियंत्रण समूह की तुलना में पीए-उपचारित समूह में आरओएस और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संभावित स्तर को काफी कम करने के लिए पाया गया था। इस बीच, पीडी ने एलसी 3-II / एलसी 3-आई स्तरों में वृद्धि की और नियंत्रण समूह की तुलना में पीए-उपचारित समूह में पी 62 / एसक्यूएसटीएम 1 स्तरों को कम कर दिया। परिणामों ने संकेत दिया कि पीडी ने ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करके और ऑटोफैगी को उत्तेजित करके विट्रो में एनएएफएलडी को सुधार दिया। यह इन विट्रो मॉडल एनएएफएलडी में पीडी की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है।
Introduction
प्लैटिकोडोन ग्रैंडिफ्लोरस (पीजी), जो प्लैटिकोडोन ग्रैंडिफ्लोरस (जैक) की सूखी जड़ है। A.DC., पारंपरिक चीनी चिकित्सा (TCM) में प्रयोग किया जाता है। यह मुख्य रूप से चीन के पूर्वोत्तर, उत्तर, पूर्व, मध्य और दक्षिण-पश्चिम क्षेत्रों में उत्पादितहोता है। पीजी घटकों में ट्राइटरपेनोइड सैपोनिन, पॉलीसेकेराइड, फ्लेवोनोइड्स, पॉलीफेनोल्स, पॉलीइथाइलीन ग्लाइकोल्स, वाष्पशील तेल और खनिजशामिल हैं। पीजी का एशिया में भोजन और हर्बल दवा के रूप में उपयोग किए जाने का एक लंबा इतिहास है। परंपरागत रूप से, इस जड़ी बूटी का उपयोग फेफड़ों के रोगों के खिलाफ दवा बनाने के लिए किया जाता था। आधुनिक फार्माकोलॉजी अन्य बीमारियों के इलाज के लिए पीजी की प्रभावकारिता का प्रमाण भी प्रदान करता है। अध्ययनों से पता चला है कि पीजी का विभिन्न प्रकार की दवा-प्रेरित यकृत की चोट मॉडल पर चिकित्सीय प्रभाव पड़ता है। पीजी या प्लैटीकोडिन अर्क के आहार पूरक उच्च वसा वाले आहार-प्रेरित मोटापे और इससे संबंधित चयापचय रोगों को सुधार सकते हैं 3,4,5. पीजी से पॉलीसेकेराइड का उपयोग चूहों में एलपीएस / डी-जीएएलएन के कारण तीव्र यकृत की चोट के उपचार के लिए किया जासकता है। इसके अलावा, पीजी की जड़ों से सैपोनिन उच्च वसा वाले आहार-प्रेरित गैर-मादक स्टीटोहेपेटाइटिस (एनएएसएच) 7 को सुधारते हैं। इसके अलावा, पीजी के सबसे महत्वपूर्ण चिकित्सीय घटकों में से एक, प्लैटिकोडिन डी (पीडी), मानव हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (हेपजी 2) कोशिकाओं में कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन रिसेप्टर अभिव्यक्ति और कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन अपटेक को बढ़ा सकताहै। इसके अलावा, पीडी एपोप्टोसिस को भी प्रेरित कर सकता है और हेपजी 2 कोशिकाओं 9,10 में आसंजन, प्रवासन और आक्रमण को रोक सकता है। इस प्रकार, इस अध्ययन में, माउस हेपेटोमा एएमएल -12 कोशिकाओं का उपयोग इन विट्रो मॉडल निर्माण के लिए और इस मॉडल में पीडी के औषधीय प्रभावों और अंतर्निहित तंत्र का आगे अध्ययन करने के लिए किया जाता है।
गैर-अल्कोहल फैटी लीवर रोग (एनएएफएलडी) शब्द यकृत रोगों के एक समूह को संदर्भित करता है जिसमें सरल स्टीटोसिस, एनएएसएच, सिरोसिस और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा11 शामिल हैं। यद्यपि एनएएफएलडी के रोगजनन को पूरी तरह से समझा नहीं गया है, क्लासिक “टू-हिट” सिद्धांत से वर्तमान “मल्टीपल-हिट” सिद्धांत तक, इंसुलिन प्रतिरोध को एनएएफएलडी 12,13,14 के रोगजनन में केंद्रीय माना जाता है। अध्ययनों से पता चला है कि हेपेटोसाइट्स में इंसुलिन प्रतिरोध से मुक्त फैटी एसिड में वृद्धि हो सकती है, जो ट्राइग्लिसराइड्स बनाते हैं जो यकृत में जमा होते हैं और यकृत को फैटी15,16 बनने का कारण बनते हैं। वसा के संचय से लिपोटॉक्सिसिटी, ऑक्सीडेटिव तनाव-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम तनाव और भड़काऊ साइटोकिन रिलीज हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप एनएएफएलडी17,18 के रोगजनन और प्रगति हो सकती है। इसके अलावा, ऑटोफैगी एनएएफएलडी के रोगजनन में भी एक भूमिका निभाता है, क्योंकि यह सेलुलर इंसुलिन संवेदनशीलता, सेलुलर लिपिड चयापचय, हेपेटोसाइट चोट और जन्मजात प्रतिरक्षा 19,20,21 को विनियमित करने में शामिल है।
एनएएफएलडी22,23 के रोगजनन और संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की खोज के लिए एक आधार प्रदान करने के लिए विभिन्न प्रकार के पशु मॉडल और सेलुलर मॉडल स्थापित किए गए हैं। हालांकि, एकल पशु मॉडल एनएएफएलडी24 की सभी रोग प्रक्रियाओं की पूरी तरह से नकल नहीं कर सकते हैं। जानवरों के बीच व्यक्तिगत अंतर विभिन्न रोग संबंधी विशेषताओं को जन्म देते हैं। एनएएफएलडी के इन विट्रो अध्ययनों में यकृत कोशिका लाइनों या प्राथमिक हेपेटोसाइट्स का उपयोग प्रयोगात्मक स्थितियों में अधिकतम स्थिरता सुनिश्चित करता है। हेपेटिक लिपिड चयापचय विकृति एनएएफएलडी25 में हेपेटोसाइट लिपिड बूंद संचय के उच्च स्तर को जन्म दे सकती है। उच्च वसा वाले आहार26,27 के कारण एनएएफएलडी की नकल करने के लिए इन विट्रो मॉडल में ओलिक एसिड और ताड़ के तेल जैसे मुक्त फैटी एसिड का उपयोग किया गया है। मानव हेपेटोब्लास्टोमा सेल लाइन हेपजी 2 का उपयोग अक्सर विट्रो में एनएएफएलडी मॉडल के निर्माण में किया जाता है, लेकिन, ट्यूमर सेल लाइन के रूप में, हेपजी 2 कोशिकाओं का चयापचय सामान्यशारीरिक स्थितियों के तहत यकृत कोशिकाओं से काफी अलग है। इसलिए, दवा स्क्रीनिंग के लिए इन विट्रो एनएएफएलडी मॉडल का निर्माण करने के लिए प्राथमिक हेपेटोसाइट्स या माउस प्राथमिक हेपेटोसाइट्स का उपयोग करना ट्यूमर सेल लाइनों का उपयोग करने की तुलना में अधिक फायदेमंद है। पशु मॉडल और इन विट्रो हेपेटोसाइट मॉडल दोनों में दवा प्रभाव और चिकित्सीय लक्ष्यों की सहक्रियात्मक परीक्षा की तुलना करते हुए, ऐसा लगता है कि इन विट्रो एनएएफएलडी मॉडल के निर्माण के लिए माउस हेपेटोसाइट्स का उपयोग करने से बेहतर अनुप्रयोग क्षमता है।
यकृत में प्रवेश करने वाले मुक्त फैटी एसिड को ऊर्जा का उत्पादन करने के लिए ऑक्सीकरण किया जाता है या ट्राइग्लिसराइड्स के रूप में संग्रहीत किया जाता है। गौरतलब है कि मुक्त फैटी एसिड में एक निश्चित लिपोटॉक्सिसिटी होती है और सेलुलर डिसफंक्शन और एपोप्टोसिस12 को प्रेरित कर सकती है। पाल्मिटिक एसिड (पीए) मानव प्लाज्मा29 में सबसे प्रचुर मात्रा में संतृप्त फैटी एसिड है। जब गैर-वसा ऊतक में कोशिकाएं लंबे समय तक पीए की उच्च सांद्रता के संपर्क में आती हैं, तो यह प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के उत्पादन को उत्तेजित करता है और ऑक्सीडेटिव तनाव, लिपिड संचय और यहां तक कि एपोप्टोसिस30 का कारण बनता है। इसलिए, कई शोधकर्ता आरओएस का उत्पादन करने के लिए यकृत कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए पीए का उपयोग एक प्रेरक के रूप में करते हैं और इस प्रकार, इन विट्रो फैटी यकृत रोग मॉडल का निर्माण करते हैं और कोशिकाओं 31,32,33,34 पर कुछ सक्रिय पदार्थों के सुरक्षात्मक प्रभावों का मूल्यांकन करते हैं। यह अध्ययन पीए द्वारा प्रेरित एनएएफएलडी के सेल मॉडल पर पीडी के सुरक्षात्मक प्रभावों की जांच के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
अध्ययनों ने इस तथ्य पर प्रकाश डाला है कि एनएएफएलडी एक क्लिनिकोपैथोलॉजिकल सिंड्रोम है, जो फैटी लीवर से लेकर एनएएसएच तक है, जो सिरोसिस और यकृत कैंसर51 में प्रगति कर सकता है। एक उच्च वसा वाले आहार ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम चोंगकिंग विज्ञान और प्रौद्योगिकी आयोग (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013, और jbky20210029) और चीन पोस्टडॉक्टरल साइंस फाउंडेशन (संख्या 2021MD703919) से अनुदान द्वारा समर्थित है।
Materials
| 5% BSA Blocking Buffer | Solarbio, Beijing, China | SW3015 | |
| AML12 (alpha mouse liver 12) cell line | Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China | AML12 | |
| Beyo ECL Plus | Beyotime, Shanghai, China | P0018S | |
| Bio-safety cabinet | Esco Micro Pte Ltd, Singapore | AC2-5S1 A2 | |
| cellSens | Olympus, Tokyo, Japan | 1.8 | |
| Culture CO2 Incubator | Esco Micro Pte Ltd, Singapore | CCL-170B-8 | |
| Dexamethasone | Beyotime, Shanghai, China | ST125 | |
| Dimethyl sulfoxide | Solarbio, Beijing, China | D8371 | |
| DMEM/F12 | Hyclone, Logan, UT, USA | SH30023.01 | |
| Foetal Bovine Serum | Hyclone, Tauranga, New Zealand | SH30406.05 | |
| Graphpad software | GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA | 8.0 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | ABclonal, Wuhan, China | AS003 | |
| Hydrophobic PVDF Transfer Membrane | Merck, Darmstadt, Germany | IPFL00010 | |
| Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100× | Beyotime, Shanghai, China | C0341 | |
| MAP LC3β Antibody | Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | SC-376404 | |
| Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1 | Solarbio, Beijing, China | M8650 | |
| Olympus Inverted Microscope IX53 | Olympus, Tokyo, Japan | IX53 | |
| Palmitic Acid | Sigma, Germany | P0500 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | Hyclone, Logan, UT, USA | SV30010 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Beyotime, Shanghai, China | ST506 | |
| Phosphate Buffered Solution | Hyclone, Logan, UT, USA | BL302A | |
| Platycodin D | Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China | CSA: 58479-68-8 | |
| Protease inhibitor cocktail for general use, 100x | Beyotime, Shanghai, China | P1005 | |
| Protein Marker | Solarbio, Beijing, China | PR1910 | |
| Reactive Oxygen Species Assay Kit | Solarbio, Beijing, China | CA1410 | |
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime, Shanghai, China | P0013E | |
| SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit | Beyotime, Shanghai, China | P0012AC | |
| SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x | Beyotime, Shanghai, China | P0015 | |
| Sigma Centrifuge | Sigma, Germany | 3K15 | |
| SQSTM1/p62 Antibody | Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | SC-28359 | |
| Tecan Infinite 200 PRO | Tecan Austria GmbH, Austria | 1510002987 | |
| WB Transfer Buffer,10x | Solarbio, Beijing, China | D1060 | |
| β-Actin Mouse mAb | ABclonal, Wuhan, China | AC004 |
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