Undersøke de beskyttende effektene av platycodin d på ikke-alkoholholdig fettleversykdom i en palmitinsyreindusert in vitro-modell

Summary

Denne protokollen undersøker den beskyttende effekten av platycodin D på ikke-alkoholholdig fettleversykdom i en palmitinsyreindusert in vitro-modell .

Abstract

Forekomsten av ikke-alkoholholdig fettleversykdom (NAFLD) har økt med en alarmerende hastighet over hele verden. Platycodon grandiflorum er mye brukt som en tradisjonell etnomedisin for behandling av ulike sykdommer og er en typisk funksjonell mat som kan innlemmes i det daglige kostholdet. Studier har antydet at platycodin D (PD), en av de viktigste aktive ingrediensene i Platycodon grandiflorum, har høy biotilgjengelighet og reduserer fremdriften av NAFLD betydelig, men den underliggende mekanismen for dette er fortsatt uklar. Denne studien tar sikte på å undersøke den terapeutiske effekten av PD mot NAFLD in vitro. AML-12-celler ble forbehandlet med 300 μM palmitinsyre (PA) i 24 timer for å modellere NAFLD in vitro. Deretter ble cellene enten behandlet med PD eller fikk ingen PD-behandling i 24 timer. Nivåene av reaktive oksygenarter (ROS) ble analysert ved bruk av 2′,7′-diklor-dihydro-fluoresceindiacetat (DCFH-DA) farging, og mitokondriemembranpotensialet ble bestemt ved JC-1-fargemetoden. Videre ble proteinuttrykksnivåene av LC3-II / LC3-I og p62 / SQSTM1 i cellelysatene analysert ved vestlig blotting. PD ble funnet å signifikant redusere ROS og mitokondriemembranpotensialnivåene i den PA-behandlede gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. I mellomtiden økte PD LC3-II / LC3-I-nivåene og reduserte p62 / SQSTM1-nivåene i den PA-behandlede gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Resultatene indikerte at PD forbedret NAFLD in vitro ved å redusere oksidativt stress og stimulere autofagi. Denne in vitro-modellen er et nyttig verktøy for å studere PDs rolle i NAFLD.

Introduction

Platycodon grandiflorus (PG), som er den tørkede roten til Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., brukes i tradisjonell kinesisk medisin (TCM). Den produseres hovedsakelig i nordøst-, nord-, øst-, sentral- og sørvestregionene i Kina¹. PG-komponentene inkluderer triterpenoid saponiner, polysakkarider, flavonoider, polyfenoler, polyetylenglykoler, flyktige oljer og mineraler². PG har en lang historie med å bli brukt som mat og urtemedisin i Asia. Tradisjonelt ble denne urten brukt til å lage medisin mot lungesykdommer. Moderne farmakologi gir også bevis på effekten av PG for behandling av andre sykdommer. Studier har vist at PG har en terapeutisk effekt på en rekke legemiddelinduserte leverskademodeller. Kosttilskudd av PG eller platycodin-ekstrakter kan forbedre fettrik diettindusert fedme og relaterte metabolske sykdommer ^3,4,5. Polysakkarider fra PG kan brukes til behandling av akutt leverskade forårsaket av LPS / D-GalN hos mus⁶. Videre forbedrer saponiner fra røttene til PG fettfattig diettindusert ikke-alkoholisk steatohepatitt (NASH)⁷. Videre kan platycodin D (PD), en av de viktigste terapeutiske komponentene i PG, forbedre lipoproteinreseptorekspresjon med lav tetthet og lipoproteinopptak med lav tetthet i humant hepatocellulært karsinom (HepG2) celler⁸. Videre kan PD også indusere apoptose og hemme adhesjon, migrasjon og invasjon i HepG2-celler ^9,10. I denne studien brukes således mushepatom AML-12-celler til in vitro-modellkonstruksjon og for å studere farmakologiske effekter og underliggende mekanismer for PD i denne modellen.

Begrepet ikke-alkoholholdig fettleversykdom (NAFLD) refererer til en gruppe leversykdommer som inkluderer enkel steatose, NASH, skrumplever og hepatocellulært karsinom¹¹. Selv om patogenesen til NAFLD er ufullstendig forstått, fra den klassiske “to-hit” -teorien til den nåværende “multiple-hit” -teorien, anses insulinresistens å være sentral i patogenesen til NAFLD^12,13,14. Studier har vist at insulinresistens i hepatocytter kan føre til økte frie fettsyrer, som danner triglyserider som avsettes i leveren og forårsaker at leveren blir fet^15,16. Akkumuleringen av fett kan føre til lipotoksisitet, oksidativ stressindusert mitokondriell dysfunksjon, endoplasmatisk retikulumstress og inflammatorisk cytokinfrigivelse, noe som resulterer i patogenesen og progresjonen av NAFLD^17,18. I tillegg spiller autofagi også en rolle i patogenesen til NAFLD, da den er involvert i regulering av cellulær insulinfølsomhet, cellulær lipidmetabolisme, hepatocyttskade og medfødt immunitet 19,20,21.

En rekke dyremodeller og cellulære modeller er etablert for å gi grunnlag for å utforske patogenesen og potensielle terapeutiske mål for NAFLD^22,23. Imidlertid kan enkeltdyrmodeller ikke fullt ut etterligne alle de patologiske prosessene i NAFLD²⁴. Individuelle forskjeller mellom dyr fører til forskjellige patologiske egenskaper. Bruk av levercellelinjer eller primære hepatocytter i in vitro-studier av NAFLD sikrer maksimal konsistens i eksperimentelle forhold. Dysregulering av lipidmetabolisme i lever kan føre til høyere nivåer av akkumulering av hepatocyttlipiddråper i NAFLD²⁵. Frie fettsyrer som oljesyre og palmeolje har blitt brukt i in vitro-modellen for å etterligne NAFLD forårsaket av et fettfattig kosthold^26,27. Den humane hepatoblastomcellelinjen HepG2 brukes ofte i konstruksjonen av NAFLD-modeller in vitro, men som en tumorcellelinje er metabolismen av HepG2-celler signifikant forskjellig fra leverceller under normale fysiologiske forhold²⁸. Derfor er bruk av primære hepatocytter eller musprimære hepatocytter for å konstruere in vitro NAFLD-modellen for legemiddelscreening mer fordelaktig enn å bruke tumorcellelinjer. Sammenligning av synergistisk undersøkelse av legemiddeleffekter og terapeutiske mål i både dyremodeller og in vitro hepatocyttmodeller, ser det ut til at bruk av musehepatocytter for å konstruere in vitro NAFLD-modellen har bedre applikasjonspotensial.

Frie fettsyrer som kommer inn i leveren oksideres for å produsere energi eller lagres som triglyserider. Signifikant har frie fettsyrer en viss lipotoksisitet og kan indusere cellulær dysfunksjon og apoptose¹². Palmitinsyre (PA) er den mest tallrike mettede fettsyren i humant plasma²⁹. Når celler i ikke-fettvev blir utsatt for høye konsentrasjoner av PA i lang tid, stimulerer dette produksjonen av reaktive oksygenarter (ROS) og forårsaker oksidativt stress, lipidakkumulering og til og med apoptose³⁰. Derfor bruker mange forskere PA som en induktor for å stimulere leverceller til å produsere ROS og dermed konstruere in vitro fettleversykdomsmodellen og evaluere de beskyttende effektene av visse aktive stoffer på celler^31,32,33,34. Denne studien introduserer en protokoll for å undersøke de beskyttende effektene av PD på en cellemodell av NAFLD indusert av PA.

Protocol

AML-12-celler (en normal hepatocyttcellelinje fra mus) brukes til cellebaserte studier. Cellene hentes fra en kommersiell kilde (se Materialfortegnelse). 1. Forbehandling av AML-12-cellene for å modellere NAFLD in vitro Vedlikehold cellene i normale cellekulturmedier (DMEM pluss Hams F12 [1:1] som inneholder 0,005 mg/ml insulin, 5 ng/ml selen, 0,005 mg/ml transferrin, 40 ng/ml deksametason og 10 % føtal bovint serum [FBS], se mate…

Representative Results

Intracellulær ROS i celleneAML-12-celler ble indusert med 300 μM PA i 24 timer, og en NAFLD-cellemodell ble etablert. Deretter ble cellene behandlet med PD i 24 timer. Cellene ble merket med en DCFH-DA fluorescerende sonde, og ROS-produksjon ble observert under et fluorescensmikroskop. Resultatene av DCFH-DA-fargingen av intracellulær ROS i cellene er vist i figur 1. Resultatene viste at PD kunne redusere nivået av intracellulær ROS signifikant i cellene inkubert me…

Discussion

Studier har fremhevet det faktum at NAFLD er et kliniskpatologisk syndrom, alt fra fettlever til NASH, som kan utvikle seg til skrumplever og leverkreft⁵¹. Et fettrikt kosthold og en inaktiv livsstil er typiske risikofaktorer for NAFLD. Både ikke-medisinske terapier og narkotikaterapier for NAFLD-behandling har blitt undersøkt^51,52,53. Patogenesen til NAFLD er imidlertid ikke fullstendig klarlagt. Metod…

Materials

5% BSA Blocking Buffer	Solarbio, Beijing, China	SW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line	Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China	AML12
Beyo ECL Plus	Beyotime, Shanghai, China	P0018S
Bio-safety cabinet	Esco Micro Pte Ltd, Singapore	AC2-5S1 A2
cellSens	Olympus, Tokyo, Japan	1.8
Culture CO2 Incubator	Esco Micro Pte Ltd, Singapore	CCL-170B-8
Dexamethasone	Beyotime, Shanghai, China	ST125
Dimethyl sulfoxide	Solarbio, Beijing, China	D8371
DMEM/F12	Hyclone, Logan, UT, USA	SH30023.01
Foetal Bovine Serum	Hyclone, Tauranga, New Zealand	SH30406.05
Graphpad software	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA	8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	ABclonal, Wuhan, China	AS003
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane	Merck, Darmstadt, Germany	IPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100×	Beyotime, Shanghai, China	C0341
MAP LC3β Antibody	Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	SC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1	Solarbio, Beijing, China	M8650
Olympus Inverted Microscope IX53	Olympus, Tokyo, Japan	IX53
Palmitic Acid	Sigma, Germany	P0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	Hyclone, Logan, UT, USA	SV30010
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Beyotime, Shanghai, China	ST506
Phosphate Buffered Solution	Hyclone, Logan, UT, USA	BL302A
Platycodin D	Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China	CSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x	Beyotime, Shanghai, China	P1005
Protein Marker	Solarbio, Beijing, China	PR1910
Reactive Oxygen Species Assay Kit	Solarbio, Beijing, China	CA1410
RIPA Lysis Buffer	Beyotime, Shanghai, China	P0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit	Beyotime, Shanghai, China	P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x	Beyotime, Shanghai, China	P0015
Sigma Centrifuge	Sigma, Germany	3K15
SQSTM1/p62 Antibody	Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	SC-28359
Tecan Infinite 200 PRO	Tecan Austria GmbH, Austria	1510002987
WB Transfer Buffer,10x	Solarbio, Beijing, China	D1060
β-Actin Mouse mAb	ABclonal, Wuhan, China	AC004