Undersöker de skyddande effekterna av Platycodin D på alkoholfri fettleversjukdom i en palmitinsyrainducerad in vitro-modell

Summary

Detta protokoll undersöker de skyddande effekterna av platycodin D på alkoholfri fettleversjukdom i en palmitinsyrainducerad in vitro-modell .

Abstract

Förekomsten av alkoholfri fettlever (NAFLD) har ökat i en alarmerande takt över hela världen. Platycodon grandiflorum används ofta som en traditionell etnomedicin för behandling av olika sjukdomar och är en typisk funktionell mat som kan införlivas i den dagliga kosten. Studier har föreslagit att platycodin D (PD), en av de viktigaste aktiva ingredienserna i Platycodon grandiflorum, har hög biotillgänglighet och avsevärt mildrar utvecklingen av NAFLD, men den underliggande mekanismen för detta är fortfarande oklart. Denna studie syftar till att undersöka den terapeutiska effekten av PD mot NAFLD in vitro. AML-12-celler förbehandlades med 300 μM palmitinsyra (PA) i 24 timmar för att modellera NAFLD in vitro. Därefter behandlades cellerna antingen med PD eller fick ingen PD-behandling under 24 timmar. Nivåerna av reaktiva syreradikaler (ROS) analyserades med 2′,7′-diklor-dihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA) färgning, och mitokondriell membranpotential bestämdes med JC-1-färgningsmetoden. Dessutom analyserades proteinuttrycksnivåerna av LC3-II / LC3-I och p62 / SQSTM1 i celllysaterna med western blotting. PD visade sig signifikant minska ROS och mitokondriella membranpotentialnivåer i den PA-behandlade gruppen jämfört med kontrollgruppen. Samtidigt ökade PD LC3-II / LC3-I-nivåerna och minskade p62 / SQSTM1-nivåerna i den PA-behandlade gruppen jämfört med kontrollgruppen. Resultaten indikerade att PD förbättrade NAFLD in vitro genom att minska oxidativ stress och stimulera autofagi. Denna in vitro-modell är ett användbart verktyg för att studera PD: s roll i NAFLD.

Introduction

Platycodon grandiflorus (PG), som är den torkade roten av Platycodon grandiflorus (Jacq.) A.DC., används i traditionell kinesisk medicin (TCM). Det produceras främst i nordöstra, norra, östra, centrala och sydvästra regionerna i Kina¹. PG-komponenterna innefattar triterpenoidsaponiner, polysackarider, flavonoider, polyfenoler, polyetylenglykoler, flyktiga oljor och mineraler². PG har en lång historia av att användas som ett livsmedel och en örtmedicin i Asien. Traditionellt användes denna ört för att göra medicin mot lungsjukdomar. Modern farmakologi ger också bevis på effekten av PG för behandling av andra sjukdomar. Studier har visat att PG har en terapeutisk effekt på en mängd olika läkemedelsinducerade leverskademodeller. Kosttillskottet av PG eller platycodin extrakt kan lindra fettrik diet-inducerad fetma och dess relaterade metaboliska sjukdomar ^3,4,5. Polysackarider från PG kan användas för behandling av akut leverskada orsakad av LPS/D-GalN hos möss⁶. Dessutom förbättrar saponiner från rötterna av PG fettrik dietinducerad alkoholfri steatohepatit (NASH)⁷. Dessutom kan platycodin D (PD), en av de viktigaste terapeutiska komponenterna i PG, förbättra lågdensitetslipoproteinreceptoruttryck och lågdensitetslipoproteinupptag i humant hepatocellulärt karcinom (HepG2) celler⁸. Dessutom kan PD också inducera apoptos och hämma vidhäftning, migration och invasion i HepG2-celler ^9,10. I denna studie används således AML-12-celler från mösshepatom för in vitro-modellkonstruktion och för att ytterligare studera de farmakologiska effekterna och underliggande mekanismer för PD i denna modell.

Termen alkoholfri fettleversjukdom (NAFLD) avser en grupp leversjukdomar som inkluderar enkel steatos, NASH, cirros och hepatocellulärt karcinom¹¹. Även om patogenesen av NAFLD är ofullständigt förstådd, från den klassiska “two-hit” -teorin till den nuvarande “multiple-hit” -teorin, anses insulinresistens vara central i patogenesen av NAFLD^12,13,14. Studier har visat att insulinresistens i hepatocyter kan leda till ökade fria fettsyror, som bildar triglycerider som deponeras i levern och får levern att bli fet^15,16. Ansamling av fett kan leda till lipotoxicitet, oxidativ stressinducerad mitokondriell dysfunktion, endoplasmatisk retikulumstress och inflammatorisk cytokinfrisättning, vilket resulterar i patogenesen och progressionen av NAFLD^17,18. Dessutom spelar autofagi också en roll i patogenesen av NAFLD, eftersom den är involverad i reglering av cellulär insulinkänslighet, cellulär lipidmetabolism, hepatocytskada och medfödd immunitet 19,20,21.

En mängd olika djurmodeller och cellulära modeller har upprättats för att ge en grund för att utforska patogenesen och potentiella terapeutiska mål för NAFLD^22,23. Enstaka djurmodeller kan emellertid inte helt efterlikna alla patologiska processer i NAFLD²⁴. Individuella skillnader mellan djur leder till olika patologiska egenskaper. Användning av levercellinjer eller primära hepatocyter i in vitro-studier av NAFLD säkerställer maximal konsistens under experimentella förhållanden. Nedsatt lipidmetabolism dysregulering kan leda till högre nivåer av hepatocytlipiddroppackumulering i NAFLD²⁵. Fria fettsyror som oljesyra och palmolja har använts i in vitro-modellen för att efterlikna NAFLD orsakad av en fettrik diet^26,27. Den humana hepatoblastomcellinjen HepG2 används ofta vid konstruktion av NAFLD-modeller in vitro, men som en tumörcellinje skiljer sig metabolismen av HepG2-celler signifikant från leverceller under normala fysiologiska förhållanden²⁸. Därför är det mer fördelaktigt att använda primära hepatocyter eller primära hepatocyter hos mus för att konstruera in vitro NAFLD-modellen för läkemedelsscreening än att använda tumörcellinjer. Att jämföra den synergistiska undersökningen av läkemedelseffekter och terapeutiska mål i både djurmodeller och in vitro-hepatocytmodeller verkar det som att användning av mushepatocyter för att konstruera in vitro NAFLD-modellen har bättre applikationspotential.

Fria fettsyror som kommer in i levern oxideras för att producera energi eller lagras som triglycerider. Signifikant, fria fettsyror har en viss lipotoxicitet och kan inducera cellulär dysfunktion och apoptos¹². Palmitinsyra (PA) är den vanligaste mättade fettsyran i human plasma²⁹. När celler i icke-fettvävnad utsätts för höga koncentrationer av PA under lång tid stimulerar detta produktionen av reaktiva syreradikaler (ROS) och orsakar oxidativ stress, lipidackumulering och till och med apoptos³⁰. Därför använder många forskare PA som en inducerare för att stimulera leverceller att producera ROS och därmed konstruera in vitro-fettleversjukdomsmodellen och utvärdera de skyddande effekterna av vissa aktiva substanser på celler^31,32,33,34. Denna studie introducerar ett protokoll för att undersöka de skyddande effekterna av PD på en cellmodell av NAFLD inducerad av PA.

Protocol

AML-12-celler (en normal mushepatocytcellinje) används för de cellbaserade studierna. Cellerna erhålls från en kommersiell källa (se Materialförteckning). 1. Förbehandling av AML-12-cellerna för att modellera NAFLD in vitro Behåll cellerna i normala cellodlingsmedier (DMEM plus Hams F12 [1:1] innehållande 0,005 mg/ml insulin, 5 ng/ml selen, 0,005 mg/ml transferrin, 40 ng/ml dexametason och 10 % fetalt bovint serum [FBS], se <stron…

Representative Results

Intracellulär ROS i cellernaAML-12-celler inducerades med 300 μM PA under 24 timmar och en NAFLD-cellmodell etablerades. Därefter behandlades cellerna med PD i 24 timmar. Cellerna märktes med en DCFH-DA fluorescerande sond, och ROS-produktion observerades under ett fluorescensmikroskop. Resultaten av DCFH-DA-färgning av intracellulär ROS i cellerna visas i figur 1. Resultaten visade att PD signifikant kunde minska nivån av intracellulär ROS i cellerna inkuberade …

Discussion

Studier har belyst det faktum att NAFLD är ett kliniskt patologiskt syndrom, allt från fettlever till NASH, som kan utvecklas till cirros och levercancer⁵¹. En fettrik kost och en inaktiv livsstil är typiska riskfaktorer för NAFLD. Både icke-läkemedelsbehandlingar och läkemedelsbehandlingar för NAFLD-behandling har undersökts^51,52,53. Patogenesen av NAFLD har emellertid inte helt klarlagts. Metod…

Materials

5% BSA Blocking Buffer	Solarbio, Beijing, China	SW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line	Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China	AML12
Beyo ECL Plus	Beyotime, Shanghai, China	P0018S
Bio-safety cabinet	Esco Micro Pte Ltd, Singapore	AC2-5S1 A2
cellSens	Olympus, Tokyo, Japan	1.8
Culture CO2 Incubator	Esco Micro Pte Ltd, Singapore	CCL-170B-8
Dexamethasone	Beyotime, Shanghai, China	ST125
Dimethyl sulfoxide	Solarbio, Beijing, China	D8371
DMEM/F12	Hyclone, Logan, UT, USA	SH30023.01
Foetal Bovine Serum	Hyclone, Tauranga, New Zealand	SH30406.05
Graphpad software	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA	8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	ABclonal, Wuhan, China	AS003
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane	Merck, Darmstadt, Germany	IPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100×	Beyotime, Shanghai, China	C0341
MAP LC3β Antibody	Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	SC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1	Solarbio, Beijing, China	M8650
Olympus Inverted Microscope IX53	Olympus, Tokyo, Japan	IX53
Palmitic Acid	Sigma, Germany	P0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x)	Hyclone, Logan, UT, USA	SV30010
Phenylmethanesulfonyl fluoride	Beyotime, Shanghai, China	ST506
Phosphate Buffered Solution	Hyclone, Logan, UT, USA	BL302A
Platycodin D	Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China	CSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x	Beyotime, Shanghai, China	P1005
Protein Marker	Solarbio, Beijing, China	PR1910
Reactive Oxygen Species Assay Kit	Solarbio, Beijing, China	CA1410
RIPA Lysis Buffer	Beyotime, Shanghai, China	P0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit	Beyotime, Shanghai, China	P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x	Beyotime, Shanghai, China	P0015
Sigma Centrifuge	Sigma, Germany	3K15
SQSTM1/p62 Antibody	Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd	SC-28359
Tecan Infinite 200 PRO	Tecan Austria GmbH, Austria	1510002987
WB Transfer Buffer,10x	Solarbio, Beijing, China	D1060
β-Actin Mouse mAb	ABclonal, Wuhan, China	AC004