القياس الكمي في الوقت الحقيقي لتأثيرات TnpB المرتبط بعائلة IS200 / IS605 على نشاط Transposon
Summary
تم تحديد بروتوكول لإجراء تصوير مباشر في الوقت الفعلي لتحديد كيفية تأثير البروتين الملحق TnpB على ديناميكيات التحويل في خلايا الإشريكية القولونية الحية الفردية.
Abstract
هنا ، تم تحديد بروتوكول لإجراء تصوير مباشر في الوقت الفعلي لنشاط العناصر القابلة للنقل في الخلايا البكتيرية الحية باستخدام مجموعة من مراسلي الفلورسنت المقترنة بالنقل. على وجه الخصوص ، يوضح كيف يمكن استخدام التصوير في الوقت الفعلي لتقييم آثار البروتين الملحق TnpB على نشاط العنصر القابل للنقل IS608 ، وهو عضو في عائلة IS200 / IS605 من العناصر القابلة للنقل. عائلة IS200 / IS605 من العناصر القابلة للنقل هي عناصر متحركة وفيرة متصلة بأحد أكثر الجينات التي لا تعد ولا تحصى الموجودة في الطبيعة ، tnpB. تقترح تماثلات التسلسل أن بروتين TnpB قد يكون مقدمة تطورية لأنظمة CRISPR / Cas9. بالإضافة إلى ذلك ، تلقى TnpB اهتماما متجددا ، بعد أن ثبت أنه يعمل كنوكلياز داخلي للحمض النووي الريبي يشبه Cas. تم تحديد تأثيرات TnpB على معدلات تبديل IS608 ، وثبت أن تعبير TnpB ل IS608 يؤدي إلى ~ 5x زيادة نشاط الترانسبوزون مقارنة بالخلايا التي تفتقر إلى تعبير TnpB.
Introduction
العناصر القابلة للنقل (TEs) هي عناصر وراثية تحشد داخل جينومها المضيف عن طريق الاستئصال أو تحفيز النسخ متبوعا بإعادة الاندماج الجينومي. توجد TEs في جميع مجالات الحياة ، ويعيد التحويل هيكلة الجينوم المضيف ، ويحور مناطق الترميز والتحكم1. هذا يولد الطفرات والتنوع التي تلعب دورا مهما في التطور2،3 ، والتنمية4،5 ، والعديد من الأمراض البشرية6 ، بما في ذلك السرطان7.
باستخدام التركيبات الجينية الجديدة التي تربط جوانب نشاط النقل بمراسلي الفلورسنت ، وصف عملنا السابق تطوير نظام تجريبي يعتمد على TE IS608 البكتيري ، وهو ممثل لعائلة IS200 / IS605 واسعة الانتشار من TEs ، والتي تسمح بالتصور في الوقت الفعلي للتبديل في الخلايا الحية الفردية8 (الشكل 1). يتم عرض نظام TE في الشكل 1A. يتكون TE من تسلسل ترميز transposase ، tnpA ، محاطا بالطرف الأيسر (LE) والطرف الأيمن (RE) التكرارات غير الكاملة (IPs) ، وهي مواقع التعرف والاستئصال ل TnpA. يتم التعبير عن tnpA باستخدام المروج PLTetO1 ، والذي يتم قمعه بواسطة مثبط tet ويمكن تحريضه باستخدام anhydrotetracycline (aTc)9. يقسم TE تسلسل -10 و -35 لمروج PlacIQ1 التأسيسي 10 للمراسل الأزرق mCerulean311. كما هو موضح في الشكل 1C ، عندما يتم تحفيز إنتاج tnpA ، يمكن استئصال TE ، مما يؤدي إلى إعادة تكوين المروج. تعبر الخلية المنتجة عن mCerulean3 وتتألق باللون الأزرق. يتم دمج المحطة N من TnpA مع المراسل الأصفر فينوس12 ، مما يسمح بقياس مستويات TnpA عن طريق التألق الأصفر.
IS608 وأعضاء آخرين من عائلة IS200 / IS605 من الترانسبوزونات عادة ما يشفرون أيضا جينا ثانيا للوظيفة غير المعروفة حتى الآن ، tnpB13. بروتينات TnpB هي عائلة وفيرة للغاية ولكنها غير كاملة من النيوكليازات المشفرة بواسطة العديد من TEsالبكتيرية والقديمة 14,15 ، والتي غالبا ما تتكون من tnpB16 فقط. علاوة على ذلك ، جددت الدراسات الحديثة الاهتمام ب TnpB من خلال العثور على أن TnpB يعمل كنوكلياز داخلي قابل للبرمجة موجه بالحمض النووي الريبي يشبه كريسبر / كاس والذي سيؤدي إما إلى فواصل dsDNA أو ssDNA في ظل ظروف متنوعة17,18. ومع ذلك ، لا يزال من غير الواضح ما هو الدور الذي قد يلعبه TnpB في تنظيم النقل. لإجراء تصور في الوقت الفعلي لتأثيرات TnpB على تبديل IS608 ، تم إنشاء نسخة من transposon ، بما في ذلك منطقة الترميز من TnpB مع اندماج N-terminal إلى بروتين الفلورسنت الأحمر mCherry.
استكمالا للدراسات الأكثر تفصيلا على مستوى الجزء الأكبر التي أجراها مختبر كولمان19 ، يظهر هنا كيف يمكن للتصوير في الوقت الفعلي لنشاط الترانسبوزون أن يكشف كميا عن تأثير TnpB أو أي بروتينات ملحقة أخرى على ديناميكيات النقل. من خلال دمج TnpB إلى mCherry ، يتم تحديد أحداث النقل الفردية بواسطة التألق الأزرق وترتبط بمستويات التعبير عن TnpA (التألق الأصفر) و TnpB (التألق الأحمر).
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة الفريدة المقدمة هنا للتصوير في الوقت الفعلي لنشاط العناصر القابلة للنقل في الخلايا الحية هي اختبار حساس يمكنه اكتشاف التحويل مباشرة في الخلايا الحية وفي الوقت الفعلي وربط هذا النشاط بالتعبير عن البروتينات الملحقة. في حين أن الإنتاجية أقل مما يمكن تحقيقه بالطرق السائبة ، فإن هذه ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم توفير الدعم المالي لهذا البحث من خلال صناديق بدء التشغيل من جامعة كاليفورنيا.
Materials
| 2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Blue Filter Cube | Chroma | Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | Discontinued | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Ferrous Sulfate Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Glass Cover Slide | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Magnesium sulfate Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscope Heater | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Stage | Prior | ||
| Red Filter Cube | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Sapphire 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
| Slide, Microscope | Fisher Scientific | 125535B | |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Yellow Filter Cube | Chroma | Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M |
References
- Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234 (2013).
- Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).
- Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. Transposable elements as mutator genes in evolution. Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).
- Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).
- Kano, H., et al. L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism. Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).
- Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease. Genome Medicine. 1 (10), 97 (2009).
- Goodier, J. L. Retrotransposition in tumors and brains. Mobile DNA. 5, 11 (2014).
- Kim, N. H., et al. Real-time transposable element activity in individual live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).
- Lutz, R., Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).
- Calos, M. P., Miller, J. H. The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength. Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).
- Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PLoS One. 6 (3), 17896 (2011).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
- Kersulyte, D., et al. Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity. Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).
- Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
- Bao, W., Jurka, J. Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements. Mobile DNA. 4 (1), 12 (2013).
- Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).
- Altae-Tran, H., et al. The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. Science. 374 (6563), 57-65 (2021).
- Karvelis, T., et al. Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).
- Kaur, D., Kuhlman, T. E. IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention. bioRxiv. , (2022).
- Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, 36-42 (2013).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ton-Hoang, B., et al. Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication. Cell. 142 (3), 398-408 (2010).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).
