Quantificazione in tempo reale degli effetti del TnpB associato alla famiglia IS200/IS605 sull'attività di trasposone

Summary

Viene delineato un protocollo per eseguire immagini in tempo reale per quantificare come la proteina accessoria TnpB influenzi la dinamica della trasposizione nelle singole cellule vive di Escherichia coli .

Abstract

Qui, viene delineato un protocollo per eseguire immagini in tempo reale dell’attività degli elementi trasponibili in cellule batteriche vive utilizzando una suite di reporter fluorescenti accoppiati alla trasposizione. In particolare, dimostra come l’imaging in tempo reale possa essere utilizzato per valutare gli effetti della proteina accessoria TnpB sull’attività dell’elemento trasponibile IS608, un membro della famiglia di elementi trasponibili IS200/IS605. La famiglia IS200/IS605 di elementi trasponibili sono abbondanti elementi mobili collegati con uno degli innumerevoli geni presenti in natura, tnpB. Le omologie di sequenza propongono che la proteina TnpB possa essere un precursore evolutivo dei sistemi CRISPR/Cas9. Inoltre, TnpB ha ricevuto un rinnovato interesse, avendo dimostrato di agire come un’endonucleasi del DNA guidata da RNA simile al Cas. Gli effetti di TnpB sui tassi di trasposizione di IS608 sono quantificati ed è dimostrato che l’espressione di TnpB di IS608 si traduce in ~5 volte maggiore attività di trasposone rispetto alle cellule prive di espressione di TnpB.

Introduction

Gli elementi trasponibili (TE) sono elementi genetici che si mobilitano all’interno dei loro genomi ospiti per escissione o copia catalizzata seguita da reintegrazione genomica. I TE esistono in tutti i domini della vita e la trasposizione ristruttura il genoma ospite, mutando le regioni codificanti e di controllo¹. Ciò genera mutazioni e diversità che svolgono un ruolo importante nell’evoluzione^2,3, nello sviluppo ^4,5 e in diverse malattie umane^6, incluso il cancro⁷.

Utilizzando nuovi costrutti genetici che accoppiano aspetti dell’attività trasposizionale a reporter fluorescenti, il nostro lavoro precedente ha descritto lo sviluppo di un sistema sperimentale basato sul batterico TE IS608, un rappresentante della diffusa famiglia di TE IS200/IS605, che consente la visualizzazione in tempo reale della trasposizione in singole cellule vive⁸ (Figura 1). Il sistema TE è mostrato nella Figura 1A. Il TE comprende la sequenza codificante della trasposasi, tnpA, affiancata da ripetizioni palindromiche imperfette (IP) dell’estremità sinistra (LE) e dell’estremità destra (RE), che sono i siti di riconoscimento ed escissione per TnpA. tnpA è espresso utilizzando il promotore P_LTetO1, che viene represso dal repressore tet ed è inducibile con aniidrotetraciclina (aTc)⁹. Il TE divide le sequenze -10 e -35 di un promotore costitutivo P_lacIQ1 ¹⁰ per il reporter blu mCerulean3¹¹. Come mostrato nella figura 1C, quando viene indotta la produzione di tnpA, il TE può essere asportato, portando alla ricostituzione del promotore. La cellula prodotta esprime mCerulean3 e fluoresce di blu. L’N-terminale del TnpA è fuso al reporter giallo Venere¹², permettendo la misurazione dei livelli di TnpA mediante fluorescenza gialla.

IS608 e altri membri della famiglia di trasposoni IS200/IS605 codificano tipicamente anche un secondo gene della funzione finora sconosciuta, tnpB¹³. Le proteine TnpB sono una famiglia di nucleasi tremendamente abbondante ma non perfettamente caratterizzata codificata da diversi TE batterici e archeali 14,15^, che spesso consistono solo di tnpB ¹⁶. Inoltre, studi recenti hanno rinnovato l’interesse per il TnpB scoprendo che il TnpB funziona come un’endonucleasi programmabile guidata da RNA simile a CRISPR / Cas che produrrà rotture di dsDNA o ssDNA in diverse condizioni^17,18. Tuttavia, non è chiaro quale ruolo possa svolgere il TnpB nella regolamentazione del recepimento. Per eseguire la visualizzazione in tempo reale degli effetti di TnpB sulla trasposizione IS608, è stata creata una versione del trasposone, inclusa la regione codificante di TnpB con una fusione N-terminale alla proteina fluorescente rossa mCherry.

A complemento di studi più dettagliati a livello di massa eseguiti dal laboratorio Kuhlman¹⁹, viene mostrato qui come l’imaging in tempo reale dell’attività dei trasposoni possa rivelare quantitativamente l’impatto di TnpB o di qualsiasi altra proteina accessoria sulla dinamica trasposizionale. Fondendo TnpB a mCherry, i singoli eventi trasposizionali sono identificati dalla fluorescenza blu e correlati con i livelli di espressione di TnpA (fluorescenza gialla) e TnpB (fluorescenza rossa).

Protocol

1. Preparazione di colture batteriche Coltivare E. coli ceppo MG1655 con costrutti di trasposone plasmidico (precedentemente descritti in Kim et al.8) durante la notte in LB con gli antibiotici appropriati (25 μg/mL di kanamicina, vedi Tabella dei materiali) a 37 °C.NOTA: Le sequenze dei costrutti utilizzati e le relative sequenze sono disponibili come numeri di adesione GenBank20 OP581959, OP581957, OP581958, OP717…

Representative Results

Questo metodo di visualizzazione dell’attività del trasposone nelle cellule vive mediante microscopia a fluorescenza, pur avendo un rendimento inferiore rispetto alle misurazioni di fluorescenza di massa, consente la visualizzazione diretta dell’attività del trasposone nelle singole cellule vive. Gli eventi di escissione del trasposone determinano la ricostituzione del promotore per mCerulean3 (Figura 1), consentendo l’identificazione delle cellule sottoposte ad attività di trasposone mediante fluorescenza blu brillan…

Discussion

Il metodo unico presentato qui per l’imaging in tempo reale dell’attività degli elementi trasponibili nelle cellule vive è un saggio sensibile in grado di rilevare direttamente la trasposizione nelle cellule vive e in tempo reale e correlare questa attività con l’espressione di proteine accessorie. Mentre il throughput è inferiore a quello che può essere ottenuto con metodi di massa, questo metodo raggiunge misurazioni dettagliate dell’attività TE e dell’espressione proteica nelle singole cellule viventi.

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Materials

2 Ton Clear Epoxy	Devcon	31345
Agarose	Sigma-Aldrich	5066
Ammonium sulfate	Sigma-Aldrich	AX1385-1
Anhydrotetracycline hydrochloride	Sigma-Aldrich	37919
Argon Laser	Melles Griot	35-IMA-840-015
Blue Filter Cube	Chroma	Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M
D(+)Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Eclipse Ti-E Microscope	Nikon		Discontinued
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene)	Eppendorf North America Biotools	22491504
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene)	Eppendorf North America Biotools	22491555
Ferrous Sulfate Acs 500 g	Fisher Scientific	706834
Fiji			Fiji (imagej.net)
Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated)	Fisher Scientific	BP9723-2
Glass Cover Slide	Fisher Scientific	12-542B
Kanamycin Sulfate	Sigma-Aldrich	1355006
Magnesium sulfate Cert Ac	Fisher Scientific	XXM63SP3KG
Microscope Heater	World Precision Instruments	96810-1
Potassium Phosphate Monobasic	Fisher Scientific	17001H
ProScan III Stage	Prior
Red Filter Cube	Chroma	Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M
Sapphire 561 LP Laser	Coherent	1170412
Slide, Microscope	Fisher Scientific	125535B
Thiamine Hydrochloride	Sigma-Aldrich (SIAL)	T1270-100G
Ti-LU4 Laser Launch	Nikon
Yellow Filter Cube	Chroma	Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M