Echtzeit-Quantifizierung der Auswirkungen von IS200/IS605-Familien-assoziiertem TnpB auf die Transposonaktivität
Summary
Es wird ein Protokoll skizziert, um Live-Echtzeit-Bildgebung durchzuführen, um zu quantifizieren, wie das akzessorische Protein TnpB die Dynamik der Transposition in einzelnen lebenden Escherichia coli-Zellen beeinflusst.
Abstract
Hier wird ein Protokoll skizziert, um eine Live-Echtzeit-Bildgebung der transponierbaren Elementaktivität in lebenden Bakterienzellen unter Verwendung einer Reihe von fluoreszierenden Reportern durchzuführen, die mit der Transposition gekoppelt sind. Insbesondere wird gezeigt, wie Echtzeit-Bildgebung verwendet werden kann, um die Auswirkungen des akzessorischen Proteins TnpB auf die Aktivität des transponierbaren Elements IS608, einem Mitglied der IS200/IS605-Familie transponierbarer Elemente, zu bewerten. Die IS200/IS605-Familie transponierbarer Elemente sind reichlich vorhandene mobile Elemente, die mit einem der unzähligen Gene in der Natur, tnpB, verbunden sind. Sequenzhomologien deuten darauf hin, dass das TnpB-Protein ein evolutionärer Vorläufer von CRISPR/Cas9-Systemen sein könnte. Darüber hinaus hat TnpB erneut Interesse geweckt, da gezeigt wurde, dass es als Cas-ähnliche RNA-gesteuerte DNA-Endonuklease wirkt. Die Auswirkungen von TnpB auf die Transpositionsraten von IS608 werden quantifiziert, und es wird gezeigt, dass die Expression von TnpB von IS608 zu ~5x erhöhter Transposonaktivität im Vergleich zu Zellen ohne TnpB-Expression führt.
Introduction
Transposable Elements (TEs) sind genetische Elemente, die innerhalb ihres Wirtsgenoms durch Exzision mobilisieren oder kopieren und anschließend genomische Reintegration katalysieren. TEs existieren in allen Lebensbereichen, und die Transposition strukturiert das Wirtsgenom um und mutiert kodierende und Kontrollregionen1. Dies erzeugt Mutationen und Diversität, die eine wichtige Rolle in der Evolution2,3, der Entwicklung4,5 und mehreren menschlichen Krankheiten6, einschließlich Krebs7, spielen.
Unter Verwendung neuartiger genetischer Konstrukte, die Aspekte der Transpositionsaktivität an fluoreszierende Reporter koppeln, beschrieben unsere früheren Arbeiten die Entwicklung eines experimentellen Systems basierend auf dem bakteriellen TE IS608, einem Vertreter der weit verbreiteten IS200/IS605-Familie von TEs, das die Echtzeitvisualisierung der Transposition in einzelnen lebenden Zellen ermöglicht8 (Abbildung 1). Das TE-System ist in Abbildung 1A dargestellt. Die TE umfasst die Transposase-kodierende Sequenz, tnpA, flankiert von Left End (LE) und Right End (RE) imperfect palindromic repeats (IPs), die die Erkennungs- und Exzisionsstellen für TnpA sind. tnpA wird unter Verwendung des Promotors PLTetO1 exprimiert, der durch den Tet-Repressor unterdrückt wird und mit Anhydrotetracyclin (aTc)9 induzierbar ist. Der TE teilt die -10- und -35-Sequenzen eines konstitutiven PlacI Q1-Promotors10 für den blauen Reporter mCerulean3 11 auf. Wie in Abbildung 1C gezeigt, kann der TE herausgeschnitten werden, wenn die Produktion von tnpA induziert wird, was zu einer Rekonstitution des Promotors führt. Die produzierte Zelle exprimiert mCerulean3 und fluoresziert blau. Der N-Terminus von TnpA ist mit dem gelben Reporter Venus12 verschmolzen, was die Messung der TnpA-Spiegel durch gelbe Fluoreszenz ermöglicht.
IS608 und andere Mitglieder der IS200/IS605-Familie von Transposons kodieren typischerweise auch für ein zweites Gen der bisher unbekannten Funktion, tnpB13. Die TnpB-Proteine sind eine enorm häufige, aber unvollkommen charakterisierte Familie von Nukleasen, die von mehreren bakteriellen und archaealen TEs14,15 kodiert werden, die oft nur aus tnpB16 bestehen. Darüber hinaus haben neuere Studien das Interesse an TnpB erneuert, indem sie festgestellt haben, dass TnpB als CRISPR / Cas-ähnliche programmierbare RNA-gesteuerte Endonuklease fungiert, die unter verschiedenen Bedingungen entweder dsDNA- oder ssDNA-Brüche erzeugt17,18. Es bleibt jedoch unklar, welche Rolle TnpB bei der Regulierung der Umsetzung spielen könnte. Um die Auswirkungen von TnpB auf die IS608-Transposition in Echtzeit zu visualisieren, wurde eine Version des Transposons, einschließlich der kodierenden Region von TnpB mit einer N-terminalen Fusion zum rot fluoreszierenden Protein mCherry, erstellt.
Ergänzend zu detaillierteren Bulk-Level-Studien, die vom Kuhlman-Labor19 durchgeführt wurden, wird hier gezeigt, wie Echtzeit-Bildgebung der Transposonaktivität den Einfluss von TnpB oder anderen akzessorischen Proteinen auf die Transpositionsdynamik quantitativ aufdecken kann. Durch die Fusion von TnpB zu mCherry werden die einzelnen transpositionalen Ereignisse durch blaue Fluoreszenz identifiziert und mit Expressionsniveaus von TnpA (gelbe Fluoreszenz) und TnpB (rote Fluoreszenz) korreliert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellte einzigartige Methode zur Echtzeit-Bildgebung der Aktivität transponierbarer Elemente in lebenden Zellen ist ein empfindlicher Assay, der die Transposition in lebenden Zellen und in Echtzeit direkt nachweisen und diese Aktivität mit der Expression akzessorischer Proteine korrelieren kann. Während der Durchsatz geringer ist, als dies mit Massenmethoden erreicht werden kann, erreicht diese Methode detaillierte Messungen der TE-Aktivität und Proteinexpression in einzelnen lebenden Zellen.
<p cla…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finanzielle Unterstützung für diese Forschung wurde durch Startkapital der University of California bereitgestellt.
Materials
| 2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Blue Filter Cube | Chroma | Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | Discontinued | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Ferrous Sulfate Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Glass Cover Slide | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Magnesium sulfate Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscope Heater | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Stage | Prior | ||
| Red Filter Cube | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Sapphire 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
| Slide, Microscope | Fisher Scientific | 125535B | |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Yellow Filter Cube | Chroma | Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M |
References
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