Kvantifiering i realtid av effekterna av IS200/IS605 familjeassocierad TnpB på transposonaktivitet
Summary
Ett protokoll beskrivs för att utföra live realtidsavbildning för att kvantifiera hur tillbehörsproteinet TnpB påverkar dynamiken i införlivandet i enskilda levande Escherichia coli-celler .
Abstract
Här beskrivs ett protokoll för att utföra levande realtidsavbildning av transponerbar elementaktivitet i levande bakterieceller med hjälp av en serie fluorescerande reportrar kopplade till införlivande. I synnerhet visar det hur realtidsavbildning kan användas för att bedöma effekterna av tillbehörsproteinet TnpB på aktiviteten hos det transponerbara elementet IS608, en medlem av IS200 / IS605-familjen av transponerbara element. IS200/IS605-familjen av transponerbara element är rikliga mobila element kopplade till en av de mest otaliga generna som finns i naturen, tnpB. Sekvenshomologier föreslår att TnpB-proteinet kan vara en evolutionär föregångare till CRISPR / Cas9-system. Dessutom har TnpB fått förnyat intresse, efter att ha visat sig fungera som ett Cas-liknande RNA-styrt DNA-endonukleas. Effekterna av TnpB på införlivandehastigheterna för IS608 kvantifieras, och det visas att uttrycket av TnpB av IS608 resulterar i ~ 5x ökad transposonaktivitet jämfört med celler som saknar TnpB-uttryck.
Introduction
Transponerbara element (TEs) är genetiska element som mobiliserar inom sina värdgenom genom excision eller katalyserar kopiering följt av genomisk återintegrering. TEs finns i alla livets domäner, och transponering omstrukturerar värdgenomet, muterar kodnings- och kontrollregioner1. Detta genererar mutationer och mångfald som spelar en viktig roll i evolution2,3, utveckling4,5 och flera mänskliga sjukdomar6, inklusive cancer7.
Med hjälp av nya genetiska konstruktioner som kopplar aspekter av transpositionell aktivitet till fluorescerande rapportörer beskrev vårt tidigare arbete utvecklingen av ett experimentellt system baserat på bakteriella TE IS608, en representant för den utbredda IS200 / IS605-familjen av TEs, som möjliggör visualisering i realtid av införlivande i enskilda levande celler8 (Figur 1). TE-systemet visas i figur 1A. TE består av transposaskodningssekvensen, tnpA, flankerad av vänster ände (LE) och höger ände (RE) ofullkomliga palindromiska upprepningar (IP), som är igenkännings- och excisionsställena för TnpA. tnpA uttrycks med hjälp av promotorn PLTetO1, som undertrycks av tet-repressorn och är inducerbar med anhydrotetracyklin (aTc)9. TE delar upp -10 och -35 sekvenserna av en konstitutiv PlacIQ1 promotor10 för den blå reportern mCerulean311. Som visas i figur 1C kan TE skäras ut när produktionen av tnpA induceras, vilket leder till promotorrekonstituering. Den producerade cellen uttrycker mCerulean3 och fluoresces blå. N-änden av TnpA smälts samman med den gula reportern Venus12, vilket möjliggör mätning av TnpA-nivåerna med gul fluorescens.
IS608 och andra medlemmar av IS200/IS605-familjen av transposoner kodar också vanligtvis för en andra gen av den hittills okända funktionen, tnpB13. TnpB-proteinerna är en oerhört riklig men ofullständigt karakteriserad familj av nukleaser kodade av flera bakteriella och arkeala TEs14,15, som ofta endast består av tnpB16. Dessutom har nyligen genomförda studier förnyat intresset för TnpB genom att finna att TnpB fungerar som ett CRISPR / Cas-liknande programmerbart RNA-styrt endonukleas som kommer att ge antingen dsDNA- eller ssDNA-brott under olika förhållanden17,18. Det är dock fortfarande oklart vilken roll TnpB kan spela för att reglera införlivandet. För att utföra realtidsvisualisering av effekterna av TnpB på IS608-införlivande skapades en version av transposonen, inklusive kodningsregionen för TnpB med en N-terminal fusion till det röda fluorescerande proteinet mCherry.
Som komplement till mer detaljerade studier på bulknivå utförda av Kuhlman-labbet19 visas här hur realtidsavbildning av transposonaktivitet kvantitativt kan avslöja effekten av TnpB eller andra tillbehörsproteiner på transpositionell dynamik. Genom att smälta samman TnpB till mCherry identifieras de enskilda transpositionshändelserna med blå fluorescens och korreleras med uttrycksnivåer av TnpA (gul fluorescens) och TnpB (röd fluorescens).
Protocol
Representative Results
Discussion
Den unika metoden som presenteras här för realtidsavbildning av transponerbar elementaktivitet i levande celler är en känslig analys som direkt kan detektera transponering i levande celler och i realtid och korrelera denna aktivitet med uttrycket av tillbehörsproteiner. Medan genomströmningen är lägre än vad som kan åstadkommas med bulkmetoder, uppnår denna metod detaljerade mätningar av TE-aktivitet och proteinuttryck i enskilda levande celler.
En mängd olika verktyg och tekniker…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ekonomiskt stöd för denna forskning tillhandahölls av startfonder från University of California.
Materials
| 2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Blue Filter Cube | Chroma | Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | Discontinued | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Ferrous Sulfate Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Glass Cover Slide | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Magnesium sulfate Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscope Heater | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Stage | Prior | ||
| Red Filter Cube | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Sapphire 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
| Slide, Microscope | Fisher Scientific | 125535B | |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Yellow Filter Cube | Chroma | Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M |
References
- Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234 (2013).
- Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).
- Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. Transposable elements as mutator genes in evolution. Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).
- Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).
- Kano, H., et al. L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism. Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).
- Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease. Genome Medicine. 1 (10), 97 (2009).
- Goodier, J. L. Retrotransposition in tumors and brains. Mobile DNA. 5, 11 (2014).
- Kim, N. H., et al. Real-time transposable element activity in individual live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).
- Lutz, R., Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).
- Calos, M. P., Miller, J. H. The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength. Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).
- Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PLoS One. 6 (3), 17896 (2011).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
- Kersulyte, D., et al. Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity. Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).
- Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
- Bao, W., Jurka, J. Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements. Mobile DNA. 4 (1), 12 (2013).
- Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).
- Altae-Tran, H., et al. The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. Science. 374 (6563), 57-65 (2021).
- Karvelis, T., et al. Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).
- Kaur, D., Kuhlman, T. E. IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention. bioRxiv. , (2022).
- Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, 36-42 (2013).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ton-Hoang, B., et al. Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication. Cell. 142 (3), 398-408 (2010).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).
