בידוד תאי אפיתל פיגמנט ברשתית מעיני חזיר גינאה
Summary
אנו מתארים שיטה פשוטה ויעילה לבידוד תאים של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מעיניהם של שרקנים צעירים בעלי פיגמנט. הליך זה מאפשר מעקב אחר מחקרי ביולוגיה מולקולרית על RPE המבודד, כולל ניתוח ביטוי גנים.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר את בידוד התאים של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) מעיניהם של שרקנים צעירים בעלי פיגמנט לצורך יישום פוטנציאלי במחקרי ביולוגיה מולקולרית, כולל ניתוח ביטוי גנים. בהקשר של ויסות גדילת העין וקוצר ראייה, RPE ככל הנראה ממלא תפקיד כממסר תאי לאותות מודולריים לגדילה, שכן הוא ממוקם בין הרשתית לשני קירות העין, כגון כורואיד וסקלרה. בעוד פרוטוקולים לבידוד RPE פותחו הן עבור אפרוחים והן עבור עכברים, פרוטוקולים אלה הוכיחו כי אינם ניתנים לתרגום ישיר לשרקן, שהפך למודל קוצר ראייה חשוב ונפוץ של יונקים. במחקר זה נעשה שימוש בכלים של ביולוגיה מולקולרית כדי לבחון את הביטוי של גנים ספציפיים כדי לאשר שהדגימות היו נקיות מזיהום מהרקמות הסמוכות. הערך של פרוטוקול זה כבר הוכח במחקר RNA-Seq של RPE משרקנים צעירים בעלי פיגמנט שנחשפו לקוצר ראייה אופטי הגורם לקוצר ראייה. מעבר לוויסות גדילת העיניים, לפרוטוקול זה יש יישומים פוטנציאליים נוספים במחקרים על מחלות רשתית, כולל מקולאופתיה קוצרת ראייה, אחד הגורמים המובילים לעיוורון במיופים, שבהם RPE היה מעורב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה יחסית ולאחר שהשתכללה, מניבה דגימות RPE באיכות גבוהה המתאימות ללימודי ביולוגיה מולקולרית, כולל ניתוח RNA.
Introduction
RPE מורכב משכבה ייחודית של תאים פיגמנטיים הממוקמים בין הרשתית העצבית לבין כורואיד כלי הדם, ול- RPE תפקידים מוכרים היטב בפיתוח ותחזוקה של תפקוד רשתית תקין, כולל פוטוטרנסדוקציה 1,2. לאחרונה, RPE הוקצה תפקיד מפתח נוסף בוויסות צמיחת העין3, ובכך התפתחות קוצר ראייה4. משימה זו מבוססת על המיקום הקריטי של ה-RPE, המשולב בין הרשתית לכורואיד ועל ההסכמה הרחבה כיום שצמיחת העין, ולכן שגיאות שבירה, מווסתות באופן מקומי5. ה-RPE ממלא תפקיד מפתח כממסר אותות, המקשר בין הרשתית, המקור המשוער של אותות מודולריים לגדילה, לכורואיד ולסקלרה, שתי המטרות של האותות המועברים 6,7,8.
העלייה באורך הציר המאפיינת את רוב קוצר הראייה אינה יכולה להיחשב שפירה, כאשר שינויים פתופיזיולוגיים המערבים את הרשתית, כורואיד ו / או סקלרה מייצגים תוצאות בלתי נמנעות וכעת מוכרות היטב של התארכות עיניים מוגזמת 7,9. בהקשר זה, RPE הוא אולי הפגיע ביותר, שכן, בהיותה רקמה לא מיטוטית, היא מסוגלת להכיל רק את חדר הזגוגית המתרחב על ידי מתיחה ודילול של תאים בודדים. בעוד שתפקידו בפתולוגיות הקשורות לקוצר ראייה, כגון ניוון מקולרי קוצר ראייה, עדיין לא הובן במלואו, RPE היה מעורב בפתוגנזה של מספר מחלות רשתית אחרות, כולל ניוון גיאוגרפי, אחד הגורמים המובילים לעיוורון, הקשור להפרעות מתועדות ברשתית, RPE, וכורואיד10,11, 12.
הבידוד המוצלח של תאי RPE, ללא זיהום מרקמות עיניים סמוכות, עשוי לפתוח הזדמנויות מחקר רבות להשגת תובנות חדשות לגבי המנגנונים העומדים בבסיס מגוון מחלות עיניים/רשתית. עם זאת, הבידוד של RPE הוכח כמאתגר, כאשר מחקרים רבים שפורסמו עשו שימוש בדגימות רשתית / RPE משולבות או RPE / כורואיד מסיבה זו13,14,15. מחקרים הכרוכים בבידוד מוצלח של RPE באיכות המתאימה ללימודי ביולוגיה מולקולרית הוגבלו לעיני אפרוחים ועכבר16,17. לדוגמה, שיטת בידוד RPE וייצוב RNA בו זמנית (SRIRS) שתוארה על ידי וואנג ואחרים 18. כדי לבודד תאי RPE בעכברים לא נראה לעבוד טוב בעיני שרקן. הפרוטוקול המתואר כאן מייצג חידוד של גישה שבתחילה יוצרה אבטיפוס עם עיני חורש עצים על ידי אחד המחברים (M.F.) והוכחה כמניבה דגימות RPE באיכות גבוהה, המתאימות לניתוח RNA וביולוגיה מולקולרית אחרת, מעיניהם של שרקנים צעירים בעלי פיגמנט19.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה נתאר שיטה לבידוד RPE, המתאימה לניתוח ביטוי גנים של RPE, מעיניהם של שרקנים צעירים בעלי פיגמנטים. היתרונות של פרוטוקול זה הם שהוא מניב דגימות RPE באיכות גבוהה שהן יחסית חופשיות מזיהום, עם RNA שנשמר כראוי לניתוחים ספציפיים ל-RNA, ועם זאת, הוא פשוט ויעיל יחסית. בעוד שבדוגמה המובאת כאן, דגימות RPE…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי האגודה היפנית לקידום המדע בחו”ל (S.G.), חוקר פוסט-דוקטורט ע”ש לוריס ודייוויד ריץ’ (S.G.), ומענק מהמכון הלאומי לעיניים של המכונים הלאומיים לבריאות (R01EY012392; סי’ פ”ו).
Materials
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. The retinal pigmented epithelium – from basic developmental biology research to translational approaches. The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).
- Goto, S., et al. Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells. Elife. 7, 32358 (2018).
- Rymer, J., Wildsoet, C. F. The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review. Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).
- Wallman, J., et al. Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state. Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).
- Wu, H., et al. Scleral hypoxia is a target for myopia control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).
- Troilo, D., et al. Imi – Report on experimental models of emmetropization and myopia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).
- Jiang, X., et al. Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118 (2021).
- Zhang, Y., Wildsoet, C. F. RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-related macular degeneration. New England Journal of Medicine. 358 (24), 2606-2617 (2008).
- McLeod, D. S., et al. Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration. Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982 (2009).
- Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch’s membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
- Shelton, L., et al. Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction. Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).
- Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo. International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).
- He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear. Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).
- Nickla, D. L., Wallman, J. The multifunctional choroid. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 144-168 (2010).
- Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).
- Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis. Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).
- Goto, S., et al. Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium. Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).
- De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. Retinal vascular patterns in domestic animals. Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).
- Araki, H., et al. Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation. Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
