Isolement de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes à partir d’yeux de cobaye
Summary
Nous décrivons une méthode simple et efficace pour isoler les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) des yeux de jeunes cobayes pigmentés. Cette procédure permet des études de biologie moléculaire de suivi sur l’EPR isolé, y compris des analyses d’expression génique.
Abstract
Ce protocole décrit l’isolement des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) des yeux de jeunes cobayes pigmentés pour une application potentielle dans les études de biologie moléculaire, y compris les analyses d’expression génique. Dans le contexte de la régulation de la croissance oculaire et de la myopie, l’EPR joue probablement un rôle de relais cellulaire pour les signaux modulateurs de croissance, car il est situé entre la rétine et les deux parois de l’œil, telles que la choroïde et la sclérotique. Bien que des protocoles d’isolement de l’EPR aient été développés pour les poussins et les souris, ces protocoles se sont avérés ne pas être directement transposables au cobaye, qui est devenu un modèle de myopie de mammifère important et largement utilisé. Dans cette étude, des outils de biologie moléculaire ont été utilisés pour examiner l’expression de gènes spécifiques afin de confirmer que les échantillons étaient exempts de contamination par les tissus adjacents. La valeur de ce protocole a déjà été démontrée dans une étude RNA-Seq de l’EPR de jeunes cobayes pigmentés exposés à un défocalisation optique induisant la myopie. Au-delà de la régulation de la croissance oculaire, ce protocole a d’autres applications potentielles dans les études des maladies de la rétine, y compris la maculopathie myopique, l’une des principales causes de cécité chez les myopes, dans laquelle l’EPR a été impliquée. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est relativement simple et, une fois perfectionnée, donne des échantillons d’EPR de haute qualité adaptés aux études de biologie moléculaire, y compris l’analyse de l’ARN.
Introduction
L’EPR comprend une monocouche unique de cellules pigmentées situées entre la rétine neurale et la choroïde vasculaire, et l’EPR a des rôles bien reconnus dans le développement et le maintien de la fonction rétinienne normale, y compris la phototransduction 1,2. Plus récemment, l’EPR s’est vu attribuer un rôle clé supplémentaire dans la régulation de la croissance oculaire3 et, par conséquent, dans le développement de la myopie4. Cette assignation est basée sur l’emplacement critique de l’EPR, interposé entre la rétine et la choroïde et l’acceptation désormais large que la croissance oculaire et, par conséquent, les erreurs de réfraction sont régulées localement5. On pense que le RPE joue un rôle clé en tant que relais de signaux, reliant la rétine, source supposée de signaux modulateurs de croissance, à la choroïde et à la sclérotique, les deux cibles des signaux relayés 6,7,8.
L’augmentation de la longueur axiale qui caractérise la plupart des myopies ne peut pas être considérée comme bénigne, les changements physiopathologiques impliquant la rétine, la choroïde et / ou la sclérotique représentant des conséquences inévitables et désormais bien reconnues d’un allongement oculaire excessif 7,9. Dans ce contexte, l’EPR est peut-être le plus vulnérable, car, étant un tissu non mitotique, il ne peut accueillir la chambre vitrée en expansion que par l’étirement et l’amincissement de cellules individuelles. Bien que son rôle dans les pathologies liées à la myopie, telles que la dégénérescence maculaire myope, n’ait pas encore été entièrement compris, l’EPR a été impliqué dans la pathogenèse d’un certain nombre d’autres maladies de la rétine, y compris l’atrophie géographique, l’une des principales causes de cécité, qui est associée à des anomalies documentées de la rétine, de l’EPR et de la choroïde10,11, 12.
L’isolement réussi des cellules EPR, exemptes de contamination par les tissus oculaires adjacents, ouvre potentiellement de nombreuses possibilités de recherche pour acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes sous-jacents à diverses maladies oculaires et rétiniennes. Cependant, l’isolement de l’EPR s’est avéré difficile, de nombreuses études publiées utilisant des échantillons combinés de rétine/EPR ou d’EPR/choroïde pour cette raison13,14,15. Les études impliquant l’isolement réussi de l’EPR d’une qualité adaptée aux études de biologie moléculaire ont été limitées aux yeux de poussins et de souris16,17. Par exemple, la méthode d’isolement simultané de l’EPR et de stabilisation de l’ARN (SRIRS) décrite par Wang et coll.18. Isoler les cellules EPR chez la souris ne semble pas bien fonctionner dans les yeux des cobayes. Le protocole décrit ici représente un raffinement d’une approche qui a été initialement prototypée avec des yeux de musaraigne arboricole par l’un des auteurs (M.F.) et qui s’est avérée produire des échantillons d’EPR de haute qualité, appropriés pour les analyses d’ARN et d’autres analyses de biologie moléculaire, à partir des yeux de jeunes cobayes pigmentés19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous décrivons une méthode d’isolement de l’EPR, appropriée pour les analyses d’expression génique de l’EPR, à partir des yeux de jeunes cobayes pigmentés. Les avantages de ce protocole sont qu’il produit des échantillons d’EPR de haute qualité qui sont relativement exempts de contamination, avec de l’ARN convenablement préservé pour les analyses spécifiques de l’ARN et, pourtant, est relativement simple et efficace. Alors que dans l’exemple fourni ici, les échantillons d?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude est financée par la Japan Society for the Promotion of Science Overseas Research Fellowships (S.G.), un boursier postdoctoral Loris et David Rich (S.G.) et une subvention du National Eye Institute des National Institutes of Health (R01EY012392; C.F.W.).
Materials
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
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