وصفنا طريقة بسيطة وفعالة لعزل خلايا ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) عن عيون خنازير غينيا المصطبغة الصغيرة. يسمح هذا الإجراء بمتابعة دراسات البيولوجيا الجزيئية على RPE المعزول ، بما في ذلك تحليلات التعبير الجيني.
يصف هذا البروتوكول عزل خلايا ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) عن عيون صغار خنازير غينيا المصطبغة للتطبيق المحتمل في دراسات البيولوجيا الجزيئية ، بما في ذلك تحليلات التعبير الجيني. في سياق تنظيم نمو العين وقصر النظر ، من المحتمل أن يلعب RPE دورا كمرحل خلوي للإشارات المعدلة للنمو ، حيث يقع بين شبكية العين وجداري العين ، مثل المشيمية والصلبة. في حين تم تطوير بروتوكولات لعزل RPE لكل من الكتاكيت والفئران ، فقد أثبتت هذه البروتوكولات أنها غير قابلة للترجمة مباشرة إلى خنزير غينيا ، الذي أصبح نموذجا مهما ومستخدما على نطاق واسع لقصر النظر في الثدييات. في هذه الدراسة ، تم استخدام أدوات البيولوجيا الجزيئية لفحص التعبير عن جينات معينة للتأكد من أن العينات كانت خالية من التلوث من الأنسجة المجاورة. وقد تم بالفعل إثبات قيمة هذا البروتوكول في دراسة RNA-Seq ل RPE من خنازير غينيا الصغيرة المصطبغة المعرضة لإلغاء التركيز البصري الذي يحفز قصر النظر. بالإضافة إلى تنظيم نمو العين ، فإن هذا البروتوكول له تطبيقات محتملة أخرى في دراسات أمراض الشبكية ، بما في ذلك اعتلال البقعة قصير النظر ، وهو أحد الأسباب الرئيسية للعمى في myopes ، والذي تورط فيه RPE. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة نسبيا وبمجرد إتقانها ، تنتج عينات RPE عالية الجودة مناسبة لدراسات البيولوجيا الجزيئية ، بما في ذلك تحليل الحمض النووي الريبي.
يتكون RPE من طبقة أحادية فريدة من الخلايا المصطبغة الموجودة بين الشبكية العصبية والمشيمية الوعائية ، و RPE لها أدوار معترف بها جيدا في تطوير وصيانة وظيفة الشبكية الطبيعية ، بما في ذلك النقل الضوئي 1,2. في الآونة الأخيرة ، تم تكليف RPE بدور رئيسي إضافي في تنظيم نمو العين3 ، وبالتالي تطوير قصر النظر4. يعتمد هذا التعيين على الموقع الحرج ل RPE ، المتداخل بين شبكية العين والمشيمية والقبول الواسع الآن بأن نمو العين ، وبالتالي الأخطاء الانكسارية يتم تنظيمها محليا5. يعتقد أن RPE يلعب دورا رئيسيا كمتابع إشارة ، يربط شبكية العين ، المصدر المفترض للإشارات المعدلة للنمو ، بالمشيمية والصلبة ، وهما الهدفان للإشارات المنقولة6،7،8.
لا يمكن اعتبار الزيادة في الطول المحوري التي تميز معظم قصر النظر حميدة ، حيث تمثل التغيرات الفسيولوجية المرضية التي تشمل شبكية العين و / أو المشيمية و / أو الصلبة عواقب لا مفر منها ومعترف بها الآن لاستطالة العين المفرطة 7,9. في هذا السياق ، ربما يكون RPE هو الأكثر ضعفا ، لأنه ، كونه نسيجا غير ميتوتي ، فهو قادر فقط على استيعاب الغرفة الزجاجية المتوسعة عن طريق تمدد الخلايا الفردية وترققها. في حين أن دوره في الأمراض المرتبطة بقصر النظر ، مثل الضمور البقعي قصير النظر ، لم يتم فهمه بالكامل بعد ، فقد تورط RPE في التسبب في عدد من أمراض الشبكية الأخرى ، بما في ذلك الضمور الجغرافي ، أحد الأسباب الرئيسية للعمى ، والذي يرتبط بتشوهات موثقة في شبكية العين ، RPE ، والمشيمية10,11 ، 12.
من المحتمل أن يفتح العزل الناجح لخلايا RPE ، الخالية من التلوث من أنسجة العين المجاورة ، العديد من الفرص البحثية لاكتساب رؤى جديدة حول الآليات الكامنة وراء مجموعة متنوعة من أمراض العين / الشبكية. ومع ذلك ، فقد ثبت أن عزل RPE يمثل تحديا ، حيث استخدمت العديد من الدراسات المنشورة عينات شبكية العين / RPE أو RPE / المشيمية المدمجة لهذا السبب13،14،15. اقتصرت الدراسات التي تنطوي على عزل ناجح ل RPE لجودة مناسبة لدراسات البيولوجيا الجزيئية على عيون الفرخ والفأر16,17. على سبيل المثال ، طريقة عزل RPE المتزامنة وتثبيت الحمض النووي الريبي (SRIRS) التي وصفها Wang et al.18. لا يبدو أن عزل خلايا RPE في الفئران يعمل بشكل جيد في عيون خنزير غينيا. يمثل البروتوكول الموصوف هنا تحسينا لنهج تم تصميمه في البداية بعيون زبابة الأشجار من قبل أحد المؤلفين (MF) وأثبت أنه ينتج عينات RPE عالية الجودة ، مناسبة لتحليلات الحمض النووي الريبي والبيولوجيا الجزيئية الأخرى ، من عيون خنازير غينيا الصغيرة المصطبغة19.
في هذه المقالة ، نصف طريقة لعزل RPE ، مناسبة لتحليلات التعبير الجيني RPE ، من عيون خنازير غينيا الصغيرة المصطبغة. تتمثل مزايا هذا البروتوكول في أنه ينتج عينات RPE عالية الجودة وخالية نسبيا من التلوث ، مع الحفاظ على الحمض النووي الريبي بشكل مناسب للتحليلات الخاصة بالحمض النووي الريبي ، ومع ذلك ?…
The authors have nothing to disclose.
هذه الدراسة مدعومة من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز زمالات أبحاث العلوم في الخارج (SG) ، وباحث ما بعد الدكتوراه لوريس وديفيد ريتش (SG) ، ومنحة من المعهد الوطني للعيون التابع للمعاهد الوطنية للصحة (R01EY012392; كف. و.).
1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |