Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Guinea Pig Gözlerinden İzolasyonu
Summary
Retinal pigment epitel (RPE) hücrelerinin hücrelerini genç pigmentli kobayların gözlerinden izole etmek için basit ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu prosedür, gen ekspresyon analizleri de dahil olmak üzere izole RPE üzerinde moleküler biyoloji çalışmalarının izlenmesine izin verir.
Abstract
Bu protokol, retinal pigment epiteli (RPE) hücrelerinin, gen ekspresyon analizleri de dahil olmak üzere moleküler biyoloji çalışmalarında potansiyel uygulama için genç pigmentli kobayların gözlerinden izolasyonunu tanımlar. Göz büyümesinin düzenlenmesi ve miyopi bağlamında, RPE muhtemelen retina ile koroid ve sklera gibi gözün iki duvarı arasında yer aldığı için büyüme modülatör sinyalleri için hücresel bir röle olarak rol oynar. RPE’yi izole etmek için protokoller hem civcivler hem de fareler için geliştirilmiş olsa da, bu protokollerin önemli ve yaygın olarak kullanılan bir memeli miyopi modeli haline gelen kobaya doğrudan çevrilemediği kanıtlanmıştır. Bu çalışmada, örneklerin bitişik dokulardan kontaminasyon içermediğini doğrulamak için spesifik genlerin ekspresyonunu incelemek için moleküler biyoloji araçları kullanılmıştır. Bu protokolün değeri, miyopiye neden olan optik defokusa maruz kalan genç pigmentli kobaylardan RPE’nin RNA-Seq çalışmasında zaten gösterilmiştir. Göz büyümesi düzenlemesinin ötesinde, bu protokolün, RPE’nin dahil olduğu miyoplarda körlüğün önde gelen nedenlerinden biri olan miyop makülopati de dahil olmak üzere retina hastalıklarının çalışmalarında başka potansiyel uygulamaları vardır. Bu tekniğin temel avantajı, nispeten basit olması ve bir kez mükemmelleştirildikten sonra, RNA analizi de dahil olmak üzere moleküler biyoloji çalışmaları için uygun yüksek kaliteli RPE örnekleri vermesidir.
Introduction
RPE, nöral retina ve vasküler koroid arasında yer alan pigmentli hücrelerin benzersiz bir tek katmanından oluşur ve RPE, fototransdüksiyon 1,2 de dahil olmak üzere normal retina fonksiyonunun geliştirilmesinde ve sürdürülmesinde iyi bilinen rollere sahiptir. Daha yakın zamanlarda, RPE’ye göz büyümesi düzenlemesi3’te ve dolayısıyla miyopi4’ün gelişiminde ek bir anahtar rol verilmiştir. Bu atama, RPE’nin retina ve koroid arasına yerleştirilen kritik konumuna ve göz büyümesinin ve dolayısıyla kırma kusurlarının yerel olarak düzenlendiği yönündeki geniş kabule dayanmaktadır5. RPE’nin, büyüme modülatörü sinyallerin varsayılan kaynağı olan retinayı, iletilen sinyallerin iki hedefi olan koroid ve skleraya bağlayan bir sinyal rölesi olarak kilit bir rol oynadığına inanılmaktadır 6,7,8.
Çoğu miyopiyi karakterize eden aksiyel uzunluktaki artış iyi huylu olarak kabul edilemez, retina, koroid ve / veya sklerasa içeren patofizyolojik değişiklikler aşırı oküler uzamanın kaçınılmaz ve şimdi iyi bilinen sonuçlarını temsil eder 7,9. Bu bağlamda, RPE belki de en savunmasız olanıdır, çünkü mitotik olmayan bir doku olarak, genişleyen vitreus odasını ancak bireysel hücrelerin gerilmesi ve inceltilmesiyle barındırabilir. Miyop makula dejenerasyonu gibi miyopi ile ilişkili patolojilerdeki rolü henüz tam olarak anlaşılamamış olsa da, RPE, retina, RPE ve koroid10,11’de belgelenmiş anormalliklerle ilişkili olan körlüğün önde gelen nedenlerinden biri olan coğrafi atrofi de dahil olmak üzere bir dizi başka retina hastalığının patogenezinde rol oynamıştır. 12.
RPE hücrelerinin komşu oküler dokulardan kontaminasyondan arındırılmış başarılı izolasyonu, çeşitli göz / retina hastalıklarının altında yatan mekanizmalar hakkında yeni bilgiler edinmek için potansiyel olarak birçok araştırma fırsatı sunmaktadır. Bununla birlikte, RPE’nin izolasyonunun zor olduğu kanıtlanmıştır, bu nedenle kombine retina / RPE veya RPE / koroid örneklerini kullanan birçok yayınlanmış çalışma ile13,14,15. Moleküler biyoloji çalışmalarına uygun kalitede RPE’nin başarılı bir şekilde izole edilmesini içeren çalışmalar civciv ve fare gözleri ile sınırlı kalmıştır16,17. Örneğin, Wang ve ark.18 tarafından tanımlanan eşzamanlı RPE izolasyonu ve RNA stabilizasyonu (SRIRS) yöntemi. Farelerde RPE hücrelerini izole etmek, kobay gözlerinde iyi çalışmıyor gibi görünmektedir. Burada açıklanan protokol, başlangıçta yazarlardan biri (M.F.) tarafından ağaç sivri gözlerle prototiplenen ve genç pigmentli kobayların gözlerinden RNA ve diğer moleküler biyoloji analizleri için uygun yüksek kaliteli RPE örnekleri verdiği kanıtlanmış bir yaklaşımın iyileştirilmesini temsil etmektedir19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, RPE gen ekspresyon analizleri için uygun olan RPE’yi genç, pigmentli kobayların gözünden izole etmek için bir yöntem anlatılmaktadır. Bu protokolün esası, RNA’nın RNA’ya özgü analizler için uygun şekilde korunduğu ve yine de nispeten basit ve verimli olduğu için, nispeten kontaminasyondan arındırılmış yüksek kaliteli RPE örnekleri vermesidir. Burada verilen örnekte, RPE örnekleri genç (2 haftalık) bir kobayın gözünden toplanırken, protokol yaşlı (genç yetişkin) hayvanlar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Japonya Bilimin Desteklenmesi Derneği Denizaşırı Araştırma Bursu (SG), Loris ve David Rich Doktora Sonrası Bursu (SG) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Göz Enstitüsü’nden (R01EY012392; C.F.W.)
Materials
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. The retinal pigmented epithelium – from basic developmental biology research to translational approaches. The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).
- Goto, S., et al. Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells. Elife. 7, 32358 (2018).
- Rymer, J., Wildsoet, C. F. The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review. Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).
- Wallman, J., et al. Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state. Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).
- Wu, H., et al. Scleral hypoxia is a target for myopia control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).
- Troilo, D., et al. Imi – Report on experimental models of emmetropization and myopia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).
- Jiang, X., et al. Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118 (2021).
- Zhang, Y., Wildsoet, C. F. RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-related macular degeneration. New England Journal of Medicine. 358 (24), 2606-2617 (2008).
- McLeod, D. S., et al. Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration. Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982 (2009).
- Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch’s membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
- Shelton, L., et al. Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction. Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).
- Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo. International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).
- He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear. Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).
- Nickla, D. L., Wallman, J. The multifunctional choroid. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 144-168 (2010).
- Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).
- Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis. Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).
- Goto, S., et al. Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium. Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).
- De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. Retinal vascular patterns in domestic animals. Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).
- Araki, H., et al. Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation. Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
