Etablering og kultur af patientafledte brystorganoider
Summary
En detaljeret protokol gives her til etablering af humane brystorganoider fra patientafledte brysttumorresektioner eller normalt brystvæv. Protokollen giver omfattende trinvise instruktioner til dyrkning, frysning og optøning af humane patientafledte brystorganoider.
Abstract
Brystkræft er en kompleks sygdom, der er klassificeret i flere forskellige histologiske og molekylære undertyper. Patientafledte brysttumororganoider udviklet i vores laboratorium består af en blanding af flere tumorafledte cellepopulationer og repræsenterer således en bedre tilnærmelse af tumorcellediversitet og miljø end de etablerede 2D-kræftcellelinjer. Organoider tjener som en ideel in vitro-model , der giver mulighed for celle-ekstracellulære matrixinteraktioner, der vides at spille en vigtig rolle i celle-celle-interaktioner og kræftprogression. Patientafledte organoider har også fordele i forhold til musemodeller, da de er af menneskelig oprindelse. Desuden har de vist sig at rekapitulere den genomiske, transkriptomiske såvel som metaboliske heterogenitet af patienttumorer; Således er de i stand til at repræsentere tumorkompleksitet såvel som patientdiversitet. Som et resultat er de klar til at give mere nøjagtig indsigt i målopdagelse og validering og lægemiddelfølsomhedsanalyser. I denne protokol giver vi en detaljeret demonstration af, hvordan patientafledte brystorganoider etableres fra resekterede brysttumorer (kræftorganoider) eller reduktivt mammoplastikafledt brystvæv (normale organoider). Dette efterfølges af en omfattende redegørelse for 3D-organoidkultur, ekspansion, passering, frysning samt optøning af patientafledte brystorganoidkulturer.
Introduction
Brystkræft (BC) er den hyppigst forekommende malignitet hos kvinder med 287,850 nye tilfælde, der anslås at blive diagnosticeret i USA i 20221. På trods af de seneste fremskridt inden for tidlig påvisning med årlige screeninger, målrettede terapier og en bedre forståelse af genetisk disposition hersker det at være den næststørste årsag til kræftdødsfald hos kvinder i USA med > 40.000 dødsfald tilskrives brystkræft årligt1. Brystkræft klassificeres i øjeblikket i flere undertyper baseret på histopatologisk og molekylær evaluering af den primære tumor. Bedre subtype stratificering har forbedret patientresultater med subtype-specifikke behandlingsmuligheder2. For eksempel har identifikationen af HER2 som en proto-onkogen3 ført til udviklingen af Trastuzumab, hvilket har gjort denne meget aggressive undertype håndterbar hos de fleste patienter4. Yderligere forskning i genetik og transkriptomik af denne komplekse sygdom på en patientspecifik måde vil hjælpe med at udvikle og forudsige bedre patientspecifikke personaliserede behandlingsregimer 2,5. Patientafledte organoider (PDO’er) er en lovende ny model til at få indsigt i kræft på molekylært niveau, identificere nye mål eller biomarkører og designe nye behandlingsstrategier 6,7,8.
BOB’er er flercellede, tredimensionelle (3D) strukturer afledt af frisk resekterede primære vævsprøver 8,9. De dyrkes tredimensionelt ved at være indlejret i en hydrogelmatrix, typisk sammensat af en kombination af ekstracellulære matrix (ECM) proteiner, og kan derfor bruges til at studere tumorcelle-ECM-interaktioner. BDO’er repræsenterer patientdiversitet og rekapitulerer cellulær heterogenitet og genetiske egenskaber ved tumoren10,11,12. At være in vitro-modeller giver de mulighed for genetisk manipulation og lægemiddelskærme med høj kapacitet13,14,15. Endvidere kan BDO’er plausibelt bruges til at evaluere patientens lægemiddelfølsomhed og behandlingsstrategier parallelt med klinikken og hjælpe med at forudsige patientresultater16,17,18. Udover kemoterapi er visse organoidmodeller også blevet brugt til at undersøge individuelle patientresponser på kemostråling19,20. I betragtning af den lovende anvendelighed af BDO’er til forskning og klinisk brug har National Cancer Institute initieret et internationalt konsortium, The Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, for at generere og levere disse tumorafledte nye kræftmodeller. Mange af de organoidmodeller af forskellige kræftformer, der er udviklet gennem HCMI, er tilgængelige via American Type Culture Collection (ATCC)22.
Normale brystorganoider har vist sig at bestå af forskellige epitelcellepopulationer, der er til stede i brystkirtlen 11,23 og tjener således som gode modeller til at studere grundlæggende biologiske processer, analysere drivermutationer, der forårsager tumorgenese, og til kræftcelle-afstamningsundersøgelser 6,15 . Brysttumororganoidmodeller er blevet brugt til at identificere nye mål, der er opmuntrende udsigter til at udvikle nye terapier, især for resistente tumorer24,25,26. Ved hjælp af patientafledte xenograft (PDX) og matchede PDX-afledte organoidmodeller (PDxO) af behandlingsresistente brysttumorer viste Guillen et al., at organoider er kraftfulde modeller for præcisionsmedicin, som kan udnyttes til at evaluere lægemiddelresponser og beslutninger om direkte terapi parallelt28. Desuden giver udviklingen af nye samkulturmetoder til dyrkning af BDO’er med forskellige immunceller27,28,29, fibroblaster 30,31 og mikrober 32,33 mulighed for at studere tumormikromiljøets indvirkning på kræftprogression. Mens mange sådanne co-kultur metoder aktivt etableres for BDO’er afledt af bugspytkirtlen eller kolorektal tumorer, lignende etablerede co-kultur metoder til bryst BDO’er er kun blevet rapporteret for naturlige dræberceller34 og fibroblaster35.
Den første biobank med >100 patientafledte organoider, der repræsenterer forskellige brystkræftundertyper, blev udviklet af Hans Clevers-gruppen36,37. Som en del af denne indsats udviklede Clevers-gruppen også det første komplekse dyrkningsmedium til brystorganoidvækst, som i øjeblikket er meget udbredt36. En opfølgende undersøgelse gav en omfattende redegørelse for etablering og dyrkning af bryst-BOB’er og patientafledte organoide xenotransplantater (PDOX’er)38. Welm-laboratoriet udviklede en stor samling BC PDX-modeller og PDxO’er, der dyrkes i et forholdsvis enklere vækstmedium indeholdende føtalt bovint serum (FBS) og færre vækstfaktorer39,40. Vi har selvstændigt udviklet og karakteriseret en lang række naive patientafledte brystkræftorganoidmodeller11 og deltaget i udviklingen af BC BOB-modeller som en del af HCMI-initiativet21. Her sigter vi mod at give en praktisk vejledning, der beskriver den metode, vi anvender til at generere patientafledte brystorganoidmodelsystemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vores laboratorium har med succes anvendt ovenstående protokoller til at etablere organoider fra naive tumorresektioner eller skrabninger. Vi har også brugt denne protokol til at udvikle normale organoider fra brystvæv opnået via reduktive mammoplastiker eller fra kræftpatienters tilstødende eller distale normale brystvæv. Omkring 30% -40% af de resekterede primære tumorer resulterede i vellykkede langsigtede (>passage 8) tumororganoidkulturer. De tumororganoide linjer, der tilspidsede efter et par passa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke medlemmer af Spector-laboratoriet for kritiske diskussioner i løbet af dette arbejde. Vi takker Norman Sachs og Hans Clevers (Hubrecht Institute, Holland) for oprindeligt at give os deres organoid dyrkningsprotokol. Vi anerkender CSHL Cancer Center Histology and Microscopy Shared Resources for tjenester og teknisk ekspertise (NCI 2P3OCA45508). Vi takker Dr. Qing Gao for hjælp med histologisk prøveforberedelse. Vi er taknemmelige for støtten fra Dr. Karen Kostroff (Northwell Health) for at give patienter tumorprøver. Vi værdsætter også Northwell Health Biobanking-teamets indsats for prøvetagning, og vi takker patienterne og deres familier for at donere væv til forskning. Denne forskning blev støttet af CSHL / Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) og Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson og D.L.S).
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
| 175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
| 37 °C bead bath | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
| 50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
| 500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
| 6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
| 96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
| BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
| BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
| Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
| Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
| Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
| FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
| HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
| HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
| Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
| Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
| Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
| N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
| Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
| P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
| p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
| Parafilm | transparent film | ||
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
| Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
| Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
| pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
| Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
| R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
| Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
| Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
| TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
- Greenwalt, I., Zaza, N., Das, S., Li, B. D. Precision Medicine and Targeted Therapies in Breast Cancer. Surgical Oncology Clinics of North America. 29 (1), 51-62 (2020).
- di Fiore, P. P., Pierce, J. H., Kraus, M. H., Segatto, O., King, C. R., Aaronson, S. A. erbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. Science. 237 (4811), 178 (1987).
- Hortobagyi, G. N., et al. Breast. AJCC Cancer Staging Manual. 4 (4), 589-636 (2017).
- Goutsouliak, K., et al. Towards personalized treatment for early stage HER2-positive breast cancer. Nature reviews. Clinical oncology. 17 (4), 233 (2020).
- Tuveson, D., Clevers, H. Cancer modeling meets human organoid technology. Science. 364 (6444), 952-955 (2019).
- Huang, L., et al. PDX-derived organoids model in vivo drug response and secrete biomarkers. JCI Insight. 5 (21), (2020).
- Wood, L. D., Ewald, A. J. Organoids in cancer research: a review for pathologist-scientists. The Journal of Pathology. 254 (4), 395-404 (2021).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Sumbal, J., Budkova, Z., Traustadóttir, G. &. #. 1. 9. 3. ;., Koledova, Z. Mammary Organoids and 3D Cell Cultures: Old Dogs with New Tricks. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 273-288 (2020).
- Bhatia, S., et al. Patient-derived triple negative breast cancer organoids provide robust model systems that recapitulate tumor intrinsic characteristics. Cancer Research. , (2022).
- Huang, L., et al. Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell– and patient-derived tumor organoids. Nature Medicine. 21 (11), 1364-1371 (2015).
- Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer. The EMBO Journal. 38 (15), (2019).
- Hendriks, D., Clevers, H., Artegiani, B. CRISPR-Cas Tools and Their Application in Genetic Engineering of Human Stem Cells and Organoids. Cell Stem Cell. 27 (5), 705-731 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. Modeling Breast Cancer Using CRISPR-Cas9–Mediated Engineering of Human Breast Organoids. JNCI: Journal of the National Cancer Institute. 112 (5), 540-544 (2020).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), 2574 (2019).
- Grossman, J. E., et al. Organoid Sensitivity Correlates with Therapeutic Response in Patients with Pancreatic Cancer. Clinical Cancer Research. 28 (4), 708-718 (2022).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
- Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- . HCMI Catalog Available from: https://hcmi-searchable-catalog.ni.nih.gov/ (2022)
- . Search ATCC Available from: https://www.atcc.org/search#q=hcm&sort=relevancy&numberOfResults=24 (2022)
- Rosenbluth, J. M., et al. Organoid cultures from normal and cancer-prone human breast tissues preserve complex epithelial lineages. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Pal, P., et al. Endocrine Therapy-Resistant Breast Cancer Cells Are More Sensitive to Ceramide Kinase Inhibition and Elevated Ceramide Levels Than Therapy-Sensitive Breast Cancer Cells. Cancers. 14 (10), 2380 (2022).
- Ding, K., et al. Single cell heterogeneity and evolution of breast cancer bone metastasis and organoids reveals therapeutic targets for precision medicine. Annals of Oncology. , (2022).
- Sudhan, D. R., et al. Hyperactivation of TORC1 Drives Resistance to the Pan-HER Tyrosine Kinase Inhibitor Neratinib in HER2-Mutant Cancers. Cancer Cell. 37 (2), 183-199 (2020).
- Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
- Neal, J. T., et al. Organoid Modeling of the Tumor Immune Microenvironment. Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).
- Tsai, S., et al. Development of primary human pancreatic cancer organoids, matched stromal and immune cells and 3D tumor microenvironment models. BMC Cancer. 18 (1), 1-13 (2018).
- Öhlund, D., et al. Distinct populations of inflammatory fibroblasts and myofibroblasts in pancreatic cancer. Journal of Experimental Medicine. 214 (3), 579-596 (2017).
- Liu, J., et al. Cancer-Associated Fibroblasts Provide a Stromal Niche for Liver Cancer Organoids That Confers Trophic Effects and Therapy Resistance. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 11 (2), 407-431 (2021).
- Puschhof, J., et al. Intestinal organoid cocultures with microbes. Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).
- Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host & Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
- Chan, I. S., Ewald, A. J. Organoid Co-culture Methods to Capture Cancer Cell–Natural Killer Cell Interactions. Methods in Molecular Biology. 2463, 235-250 (2022).
- Chatterjee, S., et al. Paracrine Crosstalk between Fibroblasts and ER+ Breast Cancer Cells Creates an IL1β-Enriched Niche that Promotes Tumor Growth. iScience. 19, 388 (2019).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- . HUB Organoids: Patient in the lab Available from: https://www.huborganoids.nl (2022)
- Dekkers, J. F., et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids. Nature Protocols. 16 (4), 1936-1965 (2021).
- Guillen, K. P., et al. A human breast cancer-derived xenograft and organoid platform for drug discovery and precision oncology. Nature Cancer. 3 (2), 232 (2022).
- . PDX Portal Available from: https://pdxportal.research.bcm.edu/pdxportal/;jsessionid=3rrpefh3qlisqgbbq4vywfywc1dvn2vwaedbnizs.pdxportal?dswid=8217 (2022)
- Veeman, M. T., Slusarski, D. C., Kaykas, A., Louie, S. H., Moon, R. T. Zebrafish Prickle, a Modulator of Noncanonical Wnt/Fz Signaling, Regulates Gastrulation Movements. Current Biology. 13 (8), 680-685 (2003).
- Chen, X., Prywes, R. Serum-Induced Expression of the cdc25A Gene by Relief of E2F-Mediated Repression . Molecular and Cellular Biology. 19 (7), 4695-4702 (1999).
- Sflomos, G., et al. Atlas of lobular breast cancer models: Challenges and strategic directions. Cancers. 13 (21), 5396 (2021).
- Sharick, J. T., et al. Metabolic Heterogeneity in Patient Tumor-Derived Organoids by Primary Site and Drug Treatment. Frontiers in Oncology. 10, 1-17 (2020).
