환자 유래 유방 오가노이드의 확립 및 배양
Summary
환자 유래 유방 종양 절제술 또는 정상 유방 조직에서 인간 유방 오가노이드를 확립하기 위한 자세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 이 프로토콜은 인간 환자 유래 유방 오가노이드의 배양, 동결 및 해동에 대한 포괄적인 단계별 지침을 제공합니다.
Abstract
유방암은 여러 가지 조직학적 및 분자적 아형으로 분류되는 복잡한 질병입니다. 우리 실험실에서 개발된 환자 유래 유방 종양 오가노이드는 여러 종양 유래 세포 집단의 혼합으로 구성되므로 확립된 2D 암 세포주보다 종양 세포 다양성과 환경에 대한 더 나은 근사치를 나타냅니다. 오가노이드는 이상적인 체외 모델로 작용하여 세포-세포 상호작용 및 암 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 세포-세포 외 기질 상호작용을 가능하게 합니다. 환자 유래 오가노이드는 또한 인간 유래이기 때문에 마우스 모델에 비해 장점이 있습니다. 또한, 그들은 환자 종양의 게놈, 전사체 및 대사 이질성을 요약하는 것으로 나타났습니다. 따라서 종양 복잡성과 환자 다양성을 나타낼 수 있습니다. 그 결과, 표적 발견 및 검증과 약물 민감도 분석에 대한 보다 정확한 통찰력을 제공할 준비가 되어 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 절제된 유방 종양(암 오가노이드) 또는 환원성 유방 성형술 유래 유방 조직(정상 오가노이드)에서 환자 유래 유방 오가노이드가 어떻게 확립되는지에 대한 자세한 시연을 제공합니다. 그 다음에는 3D 오가노이드 배양, 확장, 계대, 동결 및 환자 유래 유방 오가노이드 배양의 해동에 대한 포괄적인 설명이 이어집니다.
Introduction
유방암(BC)은 여성에서 가장 흔하게 발생하는 악성 종양으로, 2022년 미국에서 287,850건의 새로운 사례가 진단된 것으로 추정됩니다1. 최근 연례 검진, 표적 치료 및 유전적 소인에 대한 더 나은 이해를 통한 조기 발견의 발전에도 불구하고 유방암은 미국 여성의 암 사망의 두 번째 주요 원인으로 우세하며 매년 >40,000명이 유방암으로 사망합니다1. 유방암은 현재 원발성 종양의 조직병리학적 및 분자적 평가에 기초하여 여러 아형으로 분류된다. 더 나은 아형 계층화는 아형별 치료 옵션으로 환자 결과를 개선했습니다2. 예를 들어, HER2를 원발암유전자(proto-oncogene)3로 식별함으로써 트라스투주맙(Trastuzumab)이 개발되었고, 이로 인해 대부분의 환자에서 매우 공격적인 아형을 관리할 수 있게 되었다4. 환자 특이적 방식으로 이 복잡한 질병의 유전학 및 전사체학에 대한 추가 연구는 더 나은 환자 맞춤형 치료 요법을 개발하고 예측하는 데 도움이 될 것이다 2,5. 환자 유래 오가노이드(PDO)는 분자 수준에서 암에 대한 통찰력을 얻고, 새로운 표적 또는 바이오마커를 식별하고, 새로운 치료 전략을 설계할 수 있는 유망한 새로운 모델입니다 6,7,8.
PDO는 갓 절제된 일차 조직 샘플로부터 유래된 다세포, 3차원(3D) 구조이다 8,9. 이들은 일반적으로 세포외 기질(ECM) 단백질의 조합으로 구성된 하이드로겔 매트릭스에 내장되어 3차원적으로 성장하므로 종양 세포-ECM 상호작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. PDO는 환자 다양성을 나타내고 종양의 세포 이질성 및 유전적 특징을 요약한다10,11,12. 시험관 내 모델이기 때문에 유전자 조작 및 고처리량 약물 스크리닝이 가능합니다13,14,15. 또한, PDO는 임상과 병행하여 환자의 약물 감수성 및 치료 전략을 평가하고 환자 결과를 예측하는 데 그럴듯하게 활용될 수 있다(16,17,18). 화학요법 외에, 화학방사선 요법에 대한 개별 환자의 반응을 조사하기 위해 특정 오가노이드 모델이 사용되었다19,20. 연구 및 임상 사용을 위한 PDO의 유망한 적용 가능성을 감안하여 국립 암 연구소(National Cancer Institute)는 이러한 종양 유래 새로운 암 모델을 생성하고 제공하기 위해 국제 컨소시엄인 HCMI(Human Cancer Models Initiative)21를 시작했습니다. HCMI를 통해 개발된 다양한 암 유형의 많은 오가노이드 모델은 ATCC(American Type Culture Collection)22를 통해 사용할 수 있습니다.
정상 유방 오가노이드는 유선에 존재하는 다양한 상피 세포 집단으로 구성되는 것으로 나타났으며11,23 따라서 기본적인 생물학적 과정을 연구하고, 종양 형성을 유발하는 드라이버 돌연변이를 분석하고, 암세포 기원 계통 연구를 위한 훌륭한 모델 역할을 합니다 6,15 . 유방 종양 오가노이드 모델은 특히 내성 종양에 대한 새로운 치료법 개발에 대한 전망을 장려하는 새로운 표적을 식별하는 데 사용되었습니다24,25,26. Guillen et al.은 치료 저항성 유방 종양의 환자 유래 이종이식(PDX) 및 일치하는 PDX 유래 오가노이드(PDxO) 모델을 사용하여 오가노이드가 정밀 의학을 위한 강력한 모델이며, 약물 반응과 직접 치료 결정을 병렬로 평가하는 데 활용할 수 있음을 보여주었습니다28. 또한, 다양한 면역 세포27,28,29, 섬유아세포30,31 및 미생물 32,33을 가진 PDO를 배양하기 위한 새로운 공동 배양 방법의 개발은 종양 미세 환경이 암 진행에 미치는 영향을 연구할 수 있는 기회를 제공합니다. 췌장 종양 또는 결장직장 종양으로부터 유래된 PDO에 대해 많은 이러한 공동배양 방법이 활발히 확립되고 있는 반면, 유방 PDO에 대해 확립된 유사한 공동배양 방법은 자연 살해 세포(34) 및 섬유아세포(35)에 대해서만 보고되었다.
다양한 유방암 아형을 대표하는 >100개의 환자 유래 오가노이드의 첫 번째 바이오뱅크는 Hans Clevers 그룹36,37에 의해 개발되었습니다. 이러한 노력의 일환으로, Clevers 그룹은 유방 오가노이드 성장을 위한 최초의 복합 배양 배지를 개발했으며, 이는 현재 널리 사용되고 있다36. 후속 연구는 유방 PDO 및 환자 유래 오가노이드 이종이식편(PDOX)의 확립 및 배양에 대한 포괄적인 설명을 제공했습니다38. Welm 연구실은 태아 소 혈청(FBS)과 더 적은 성장 인자를 포함하는 비교적 단순한 성장 배지에서 배양된 BC PDX 모델 및 PDxO의 대규모 컬렉션을 개발했습니다39,40. 우리는 순진한 환자 유래 유방암 오가노이드 모델11을 독립적으로 개발하고 특성화했으며 HCMI 이니셔티브21의 일환으로 BC PDO 모델 개발에 참여했습니다. 여기에서 우리는 환자 유래 유방 오가노이드 모델 시스템을 생성하는 데 사용하는 방법론을 자세히 설명하는 실용적인 가이드를 제공하는 것을 목표로 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리 연구실은 위의 프로토콜을 성공적으로 사용하여 순진한 종양 절제술 또는 긁힌 자국에서 오가노이드를 확립했습니다. 우리는 또한 이 프로토콜을 활용하여 환원성 유방 성형술을 통해 얻은 유방 조직 또는 암 환자의 인접 또는 원위 정상 유방 조직에서 정상 오가노이드를 개발했습니다. 절제된 원발성 종양의 약 30%-40%가 성공적인 장기(>계대 8) 종양 오가노이드 배양을 초래했습니다. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업을 진행하는 동안 비판적인 토론을 해주신 스펙터 연구소 구성원들에게 감사의 말씀을 전합니다. Norman Sachs와 Hans Clevers(네덜란드 Hubrecht Institute)가 처음에 오가노이드 배양 프로토콜을 제공한 것에 대해 감사드립니다. 우리는 서비스 및 기술 전문 지식(NCI 2P3OCA45508)에 대해 CSHL 암 센터 조직학 및 현미경 공유 리소스를 인정합니다. 조직학적 샘플 준비에 도움을 주신 Qing Gao 박사에게 감사드립니다. 환자 종양 샘플을 제공한 Karen Kostroff 박사(Northwell Health)의 지원에 감사드립니다. 또한 샘플 수집을 위한 Northwell Health Biobanking 팀의 노력에 감사드리며, 연구를 위해 조직을 기증해 주신 환자와 그 가족에게도 감사드립니다. 이 연구는 CSHL/Northwell Health(D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3(D.L.S.) 및 Leidos Biomedical HHSN26100008(David Tuveson 및 D.L.S)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
| 175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
| 37 °C bead bath | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
| 50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
| 500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
| 6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
| 96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
| BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
| BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
| Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
| Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
| Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
| FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
| HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
| HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
| Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
| Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
| Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
| N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
| Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
| P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
| p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
| Parafilm | transparent film | ||
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
| Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
| Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
| pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
| Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
| R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
| Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
| Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
| TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |
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