Etablierung und Kultivierung von patienteneigenen Brustorganoiden
Summary
Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Etablierung von humanen Brustorganoiden aus patienteneigenen Brusttumorresektionen oder normalem Brustgewebe bereitgestellt. Das Protokoll enthält eine umfassende Schritt-für-Schritt-Anleitung zum Kultivieren, Einfrieren und Auftauen von Brustorganoiden aus menschlichen Patienten.
Abstract
Brustkrebs ist eine komplexe Erkrankung, die in verschiedene histologische und molekulare Subtypen eingeteilt wurde. Die in unserem Labor entwickelten Brusttumor-Organoide von Patientinnen bestehen aus einer Mischung mehrerer Tumorzellpopulationen und stellen daher eine bessere Annäherung an die Diversität und das Milieu der Tumorzellen dar als die etablierten 2D-Krebszelllinien. Organoide dienen als ideales In-vitro-Modell , das Zell-extrazelluläre Matrix-Interaktionen ermöglicht, von denen bekannt ist, dass sie eine wichtige Rolle bei Zell-Zell-Interaktionen und der Krebsprogression spielen. Von Patienten stammende Organoide haben auch Vorteile gegenüber Mausmodellen, da sie menschlichen Ursprungs sind. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass sie die genomische, transkriptomische sowie metabolische Heterogenität von Patiententumoren rekapitulieren; Damit sind sie in der Lage, sowohl die Tumorkomplexität als auch die Patientenvielfalt abzubilden. Dadurch sind sie in der Lage, genauere Einblicke in die Entdeckung und Validierung von Zielmolekülen sowie in Tests zur Arzneimittelempfindlichkeit zu liefern. In diesem Protokoll zeigen wir detailliert, wie aus resezierten Brusttumoren (Krebsorganoide) oder aus reduktiver Mammoplastik gewonnenem Brustgewebe (normale Organoide) Brustorganoide von Patientinnen hergestellt werden. Darauf folgt eine umfassende Darstellung der 3D-Organoidkultur, der Expansion, des Durchgangs, des Einfrierens sowie des Auftauens von Brustorganoidkulturen aus der Brust.
Introduction
Brustkrebs ist die am häufigsten auftretende bösartige Erkrankung bei Frauen, wobei im Jahr 2022 schätzungsweise 287.850 neue Fälle in den Vereinigten Staaten diagnostiziert wurden1. Trotz der jüngsten Fortschritte in der Früherkennung mit jährlichen Screenings, zielgerichteten Therapien und einem besseren Verständnis der genetischen Veranlagung ist sie in den Vereinigten Staaten mit jährlich >40.000 Todesfällen auf Brustkrebs zurückzuführen die zweithäufigste Krebstodesursache bei Frauen1. Brustkrebs wird derzeit auf der Grundlage histopathologischer und molekularer Untersuchungen des Primärtumors in mehrere Subtypen eingeteilt. Eine bessere Subtyp-Stratifizierung hat die Patientenergebnisse mit subtypspezifischen Behandlungsoptionen verbessert2. So hat beispielsweise die Identifizierung von HER2 als Proto-Onkogen3 zur Entwicklung von Trastuzumab geführt, das diesen hochaggressiven Subtyp bei den meisten Patientinnen beherrschbar gemacht hat4. Weitere patientenspezifische Forschungen zur Genetik und Transkriptomik dieser komplexen Erkrankung werden dazu beitragen, bessere patientenspezifische, personalisierte Behandlungsschemata zu entwickeln und vorherzusagen 2,5. Patientenabgeleitete Organoide (PDOs) sind ein vielversprechendes neues Modell, um Einblicke in Krebs auf molekularer Ebene zu gewinnen, neue Ziele oder Biomarker zu identifizieren und neue Behandlungsstrategien zu entwickeln 6,7,8.
PDOs sind mehrzellige, dreidimensionale (3D) Strukturen, die aus frisch resezierten primären Gewebeproben gewonnen werden 8,9. Sie werden dreidimensional gezüchtet, indem sie in eine Hydrogelmatrix eingebettet werden, die typischerweise aus einer Kombination von Proteinen der extrazellulären Matrix (EZM) besteht, und können daher zur Untersuchung von Interaktionen zwischen Tumorzellen und EZM verwendet werden. PDOs repräsentieren die Patientenvielfalt und rekapitulieren die zelluläre Heterogenität und die genetischen Merkmale des Tumors10,11,12. Da es sich um In-vitro-Modelle handelt, ermöglichen sie genetische Manipulation und Hochdurchsatz-Wirkstoffscreenings13,14,15. Darüber hinaus können PDOs plausibel eingesetzt werden, um die Medikamentensensitivität und Behandlungsstrategien von Patienten parallel zur Klinik zu bewerten und dabei zu helfen, Patientenergebnisse vorherzusagen16,17,18. Neben der Chemotherapie wurden auch bestimmte Organoidmodelle verwendet, um das individuelle Ansprechen von Patienten auf die Chemobestrahlung zu untersuchen19,20. Angesichts der vielversprechenden Anwendbarkeit von PDOs für die Forschung und den klinischen Einsatz hat das National Cancer Institute ein internationales Konsortium, die Human Cancer Models Initiative (HCMI)21, ins Leben gerufen, um diese neuartigen Krebsmodelle zu generieren und bereitzustellen. Viele der Organoid-Modelle verschiedener Krebsarten, die im Rahmen des HCMI entwickelt wurden, sind über die American Type Culture Collection (ATCC)22 erhältlich.
Es hat sich gezeigt, dass normale Brustorganoide aus verschiedenen Epithelzellpopulationen bestehen, die in der Brustdrüse vorhanden sind 11,23 und daher als hervorragende Modelle für die Untersuchung grundlegender biologischer Prozesse, für die Analyse von Treibermutationen, die die Tumorentstehung verursachen, und für Studien zur Abstammungslinie von Krebszellen dienen 6,15 . Organoidmodelle für Brusttumore wurden verwendet, um neue Angriffspunkte zu identifizieren, die vielversprechende Aussichten für die Entwicklung neuer Therapien, insbesondere für resistente Tumore, darstellen24,25,26. Guillen et al. zeigten unter Verwendung von patientenabgeleiteten Xenotransplantat- (PDX) und PDX-abgeleiteten Organoidmodellen (PDxO) von behandlungsresistenten Brusttumoren, dass Organoide leistungsstarke Modelle für die Präzisionsmedizin sind, die genutzt werden können, um das Ansprechen auf Arzneimittel zu bewerten und Therapieentscheidungen parallel zu treffen28. Darüber hinaus bietet die Entwicklung neuer Kokulturmethoden zur Kultivierung von PDOs mit verschiedenen Immunzellen27,28,29, Fibroblasten 30,31 und Mikroben32,33 die Möglichkeit, den Einfluss der Tumormikroumgebung auf die Krebsprogression zu untersuchen. Während viele solcher Kokulturmethoden aktiv für PDOs etabliert werden, die aus Pankreas- oder Kolorektaltumoren gewonnen werden, wurden ähnliche etablierte Kokulturmethoden für Brust-PDOs nur für natürliche Killerzellen34 und Fibroblasten35 berichtet.
Die erste Biobank mit >100 patienteneigenen Organoiden, die verschiedene Brustkrebs-Subtypen repräsentieren, wurde von der Hans-Clevers-Gruppe entwickelt36,37. Im Rahmen dieser Bemühungen entwickelte die Clevers-Gruppe auch das erste komplexe Nährmedium für das Wachstum von Brustorganoiden, das derzeit weit verbreitet ist36. Eine Folgestudie lieferte einen umfassenden Überblick über die Etablierung und Kultur von Brust-PDOs und patienteneigenen Organoid-Xenotransplantaten (PDOXs)38. Das Welm-Labor entwickelte eine große Sammlung von BC PDX-Modellen und PDxOs, die in einem vergleichsweise einfacheren Nährmedium kultiviert werden, das fötales Kälberserum (FBS) und weniger Wachstumsfaktoren enthält39,40. Wir haben unabhängig voneinander eine große Anzahl von naiven patientenabgeleiteten Brustkrebs-Organoidmodellenentwickelt und charakterisiert 11 und waren im Rahmen der HCMI-Initiative21 an der Entwicklung von BC-PDO-Modellen beteiligt. Hier möchten wir einen praktischen Leitfaden zur Verfügung stellen, der die von uns verwendete Methodik zur Erstellung von patientenabgeleiteten Brustorganoid-Modellsystemen detailliert beschreibt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unser Labor hat die oben genannten Protokolle erfolgreich eingesetzt, um Organoide aus naiven Tumorresektionen oder -kratzerungen zu etablieren. Wir haben dieses Protokoll auch verwendet, um normale Organoide aus Brustgewebe zu entwickeln, das durch reduktive Mammoplastiken oder aus benachbartem oder distalem normalem Brustgewebe von Krebspatientinnen gewonnen wurde. Etwa 30%-40% der resezierten Primärtumoren führten zu erfolgreichen Langzeittumoren (>Passage 8) Tumor-Organoid-Kulturen. Die Tumor-Organoid-Lini…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir bedanken uns bei den Mitgliedern des Spector-Labors für die kritische Diskussion im Laufe dieser Arbeit. Wir danken Norman Sachs und Hans Clevers (Hubrecht Institute, Niederlande) für die erste Bereitstellung ihres Organoid-Kultivierungsprotokolls. Wir danken dem CSHL Cancer Center Histology and Microscopy Shared Resources für seine Dienstleistungen und sein technisches Know-how (NCI 2P3OCA45508). Wir danken Dr. Qing Gao für die Unterstützung bei der histologischen Probenvorbereitung. Wir sind dankbar für die Unterstützung von Dr. Karen Kostroff (Northwell Health) für die Bereitstellung von Patiententumorproben. Wir schätzen auch die Bemühungen des Northwell Health Biobanking-Teams bei der Probengewinnung und danken den Patienten und ihren Familien für die Spende von Gewebe für die Forschung. Diese Forschung wurde von CSHL/Northwell Health (D.L.S.), NCI 5P01CA013106-Project 3 (D.L.S.) und Leidos Biomedical HHSN26100008 (David Tuveson und D.L.S.) unterstützt.
Materials
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-1068 | |
| 175 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-308 | |
| 37 °C bead bath | |||
| 37 °C CO2 incubator | |||
| 50 mL conical tubes | VWR | 525-1077 | |
| 50 mL vacuum filtration system (0.22 µm Filter) | Millipore Sigma | SCGP00525 | SCGP00525 |
| 500 mL Rapid-Flow Filter Unit, 0.2 µm aPES membrane, 75 mm diameter | Nalgene | 566-0020 | |
| 6-well culture plates | Greiner Cellstar | 82050-842 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | VWR (Corning) | 29185-304 | |
| 96-well opaque plates | Corning | 353296 | For CTG assay |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 12587010 | |
| BioTek Synergy H4 Hybrid Microplate Reader | Fisher Scientific (Agilent) | For dual luciferase assay and CTG assay | |
| BSA fraction V (7.5%) | Thermo Fisher | 15260037 | |
| Cell Titer-Glo (CTG) Reagent | Promega | G9683 | luminescent cell viability assay |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Millipore Sigma | C5138 | Type IV |
| Cryolabels | Amazon | DTCR-1000 | Direct Thermal Cryo-Tags, White, 1.05 x 0.5" |
| Cryovials | Simport Scientific Inc. | T311-1 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher (Gibco) | 11995040 | |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Gibco | 14190-144 | DPBS |
| Epidermal growth factor (hEGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| FGF-10 (human) | Peprotech | 100-26 | |
| FGF-7/KGF (human) | Peprotech | 100-19 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | For TOPFlash Assay |
| HEK293T-HA-Rspondin1-Fc cells | R&D Systems | 3710-001-01 | Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells |
| HEPES | Life Technologies | 15630-080 | |
| Heregulinβ-1 (human) | Peprotech | 100-03 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | Phenol-red free, LDEV-free; basement membrane matrix |
| Mr. Frosty Cell Freezing Container | Thermo Fisher | 5100-0001 | |
| Mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-418 | |
| N-acetyl-l-cysteine | Millipore Sigma | A9165 | |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Fisher | 166-0045 | |
| Nicotinamide | Millipore Sigma | N0636 | |
| Noggin (human) | Peprotech | 120-10C | |
| P1000, P200, P10 pipettes with tips | |||
| p38 MAPK inhibitor (p38i) SB 202190 | Millipore Sigma | S7067 | |
| Parafilm | transparent film | ||
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Plasmid1: pRL-SV40P | Addgene | 27163 | |
| Plasmid2: M51 Super 8x FOPFlash | Addgene | 12457 | |
| Plasmid3: M50 Super 8x TOPFlash | Addgene | 12456 | |
| pluriStrainer 200 µm | pluriSelect | 43-50200-01 | |
| Primocin | Invivogen | ANT-PM-1 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Thermo Fisher (Gibco) | 12648-010 | cell freezing medium |
| Red Blood Cell lysis buffer | Millipore Sigma | 11814389001 | |
| R-spondin conditioned media | In-house or commercial from Peprotech | 120-38 | |
| Scalpel (No.10) | Sklar Instruments | Jun-10 | |
| Shaker (Incu-shaker Mini) | Benchmark | H1001-M | |
| TGF-β receptor inhibitor A 83-01 | Tocris | 2939 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Life Technologies | 12605028 | cell dissociation reagent |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Millipore Sigma | 6365779001 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (RhoKi) | Abmole Bioscience | Y-27632 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25001 |
References
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