Quantifizierung des Replikationsstresses in Ovarialkarzinomzellen mittels einzelsträngiger DNA-Immunfluoreszenz
Summary
Hier beschreiben wir eine Immunfluoreszenz-basierte Methode zur Quantifizierung des Gehalts an einzelsträngiger DNA in Zellen. Diese effiziente und reproduzierbare Methode kann verwendet werden, um den Replikationsstress zu untersuchen, ein häufiges Merkmal bei mehreren Eierstockkrebsarten. Darüber hinaus ist dieser Assay mit einer automatisierten Analysepipeline kompatibel, was seine Effizienz weiter erhöht.
Abstract
Replikationsstress ist ein Kennzeichen mehrerer Eierstockkrebsarten. Replikationsstress kann aus mehreren Quellen entstehen, einschließlich Doppelstrangbrüchen, Transkriptions-Replikationskonflikten oder amplifizierten Onkogenen, was unweigerlich zur Erzeugung von einzelsträngiger DNA (ssDNA) führt. Die Quantifizierung der ssDNA bietet daher die Möglichkeit, das Ausmaß des Replikationsstresses in verschiedenen Zelltypen und unter verschiedenen DNA-schädigenden Bedingungen oder Behandlungen zu bewerten. Neue Erkenntnisse deuten auch darauf hin, dass ssDNA ein Prädiktor für das Ansprechen auf Chemotherapeutika sein kann, die auf die DNA-Reparatur abzielen. Hier beschreiben wir eine detaillierte Immunfluoreszenz-basierte Methodik zur Quantifizierung von ssDNA. Diese Methodik beinhaltet die Markierung des Genoms mit einem Thymidin-Analogon, gefolgt von der antikörperbasierten Detektion des Analogons am Chromatin unter nicht denaturierenden Bedingungen. Abschnitte der ssDNA können als Herde unter einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden. Die Anzahl und Intensität der Herde steht in direktem Zusammenhang mit dem im Zellkern vorhandenen ssDNA-Gehalt. Wir beschreiben auch eine automatisierte Pipeline zur Quantifizierung des ssDNA-Signals. Die Methode ist schnell und reproduzierbar. Darüber hinaus macht die Einfachheit dieser Methodik sie für Hochdurchsatzanwendungen wie Arzneimittel- und genetische Screenings zugänglich.
Introduction
Genomische DNA ist häufig mehreren Angriffen aus verschiedenen endogenen und exogenen Quellen ausgesetzt1. Die Häufigkeit endogener Schäden korreliert direkt mit den Konzentrationen von Stoffwechselnebenprodukten wie reaktiven Sauerstoffspezies oder Aldehyden, die bei mehreren Krebsarten, einschließlich Eierstockkrebs, intrinsisch höher sind 2,3. Es ist zwingend erforderlich, dass DNA-Schäden effizient behoben werden. Andernfalls kann es genotoxische Läsionen und folglich Mutagenese fördern. Die Fähigkeit von Zellen, genotoxische Läsionen zu reparieren, hängt von der Funktionalität fehlerfreier DNA-Reparaturwege und der effizienten Regulation des Zellzyklusverlaufs als Reaktion auf DNA-Schäden ab. Bemerkenswert ist, dass viele Eierstockkarzinome funktionell inaktivierende Mutationen in p53 tragen und somit einen defekten G1/S-Checkpoint aufweisen, der dazu führt, dass die Zellen trotz des Vorhandenseins nicht reparierter genomischer Läsionen eine DNA-Replikation initiieren 4,5. Das Ausmaß der DNA-Schädigung bei Ovarialkarzinomen wird durch die Beobachtung noch verstärkt, dass mehr als 50% der hochgradigen serösen Ovarialkarzinome (HGSOC) Defekte in der BRCA1- und BRCA2-vermittelten homologen Rekombination, dem fehlerfreien DNA-Reparaturweg, und etwa 20% eine Amplifikation im Gen CCNE1 aufweisen, das G1-Zellen vorzeitig in die S-Phase6 drängt . Zusammen erhöht die hohe Häufigkeit von endogenen DNA-Schäden, defekten Checkpoints und fehlerhaften Reparaturwegen die Akkumulation genomischer Läsionen bei Eierstockkrebs exponentiell. Diese Läsionen können als Hindernisse für das Fortschreiten kritischer zellulärer Prozesse wie DNA-Replikation und -Transkription dienen. Wie weiter unten erörtert, katalysieren solche Hindernisse die Erzeugung von einzelsträngiger DNA (ssDNA) in Zellen.
Die Doppelhelix der DNA ist entscheidend für den Schutz des Genoms vor mehreren mutagenen Prozessen, wie z. B. spontaner Depurinierung und Depyrimidinierung, der Aktivität von Cytosin-Desaminasen und oxidativen DNA-Schäden 1,7. Im Gegensatz dazu ist ssDNA sehr anfällig für diese Mutationsereignisse. Mehrere Prozesse in Zellen können zur Erzeugung von ssDNA führen (Abbildung 1). Dazu gehören die folgenden:
(i) Stillstand der DNA-Replikationsmaschinerie: Dies führt zu einer Entkopplung der DNA-Helikase und der Polymerase, wobei Abschnitte der ssDNA 8,9 zurückbleiben.
(ii) Stillstand der Transkriptionsmaschinerie: Anhaltendes Abwürgen der RNA-Polymerase führt zur Erzeugung von dreisträngigen hybriden DNA/RNA-Strukturen, die als R-Schleifen bezeichnet werden. Bei der Bildung von R-Schleifen wird die verschobene, nicht transkribierte DNA als Einzelstrang10 freigelegt.
(iii) DNA-Endresektion: Die Initiierung einer homologiegesteuerten Reparatur erfordert die Erzeugung einer 3′-ssDNA, um die Suche nach einer homologen Sequenz11 zu katalysieren.
(iv) D-Schleife: Die Stranginvasion während der homologen Rekombination kann zur Verschiebung des komplementären Nicht-Template-Strangs führen, was zu ssDNA12 führt.
(v) Replikationsgekoppelte Lücken: Während der DNA-Replikation erfolgt die verzögerte Strangsynthese diskontinuierlich, wobei Okazaki-Fragmente zuerst erzeugt und dann ligiert werden. Eine Verzögerung oder ein Defekt bei der Verarbeitung der Okazaki-Fragmente kann ebenfalls zur Bildung von ssDNA führen. Wenn schließlich die Replikationsgabel an einem führenden Strang auf eine stockende Läsion, DNA-Polymerase und Primase stößt, kann PRIMPOL die Synthese stromabwärts reprimieren und eine ssDNA-Lücke hinter13,14 hinterlassen.
Offensichtlich treten die meisten dieser Ereignisse entweder auf, wenn die DNA-Replikationsmaschinerie genomischen Läsionen ausgesetzt ist, oder während der replikationsgekoppelten Reparatur, was darauf hindeutet, dass höhere DNA-Schäden zu erhöhten ssDNA-Spiegeln führen. Da viele dieser Ereignisse replikationsassoziiert sind, wird die Bildung von ssDNA als Marker für “Replikationsstress” in Zellen angesehen15,16.
Hier beschreiben wir einen Assay, mit dem ssDNA in Zellen zuverlässig quantifiziert werden kann. Die Einfachheit, Reproduzierbarkeit und Kostenvorteile dieses Ansatzes machen es möglich, ihn für die Beurteilung der Replikationsstressantwort in Zellen zu verwenden. Neue Studien haben gezeigt, dass der Gehalt an ssDNA auch ein Prädiktor für das Ansprechen auf eine Chemotherapie sein kann, wie z. B. Inhibitoren von PARP1/2-Enzymen, ATR und Wee1-Kinase 17,18,19,20,21. Diese Inhibitoren werden im Behandlungsschema mehrerer HGSOCs22 verfolgt. Daher kann dieser Assay auch ein nützliches Werkzeug sein, um chemotherapeutische Reaktionen in Eierstockkrebszellen vorherzusagen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wie im Protokoll erwähnt, ist es wertvoll, einige experimentelle Kontrollen einzubeziehen, um sicherzustellen, dass der Assay funktioniert. Dazu gehören sowohl eine nicht IdU-behandelte Probe als auch eine nicht mit Primärantikörpern behandelte Probe. Beide Negativkontrollen sollten Zellen liefern, die durch DAPI gefärbt sind, aber kein IdU-Signal enthalten.
Basierend auf den experimentellen Bedingungen und den verwendeten Zelllinien können unterschiedliche Antikörperverdünnungen erfor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PV wird durch den Inaugural Pedal the Cause Grant des Alvin J. Siteman Cancer Center durch die Foundation for Barnes-Jewish Hospital, den Pilot Research Grant des Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research, den Cancer Research Grant der Mary Kay Ash Foundation und die V-Foundation unterstützt. NR wird durch das NIH Cell and Molecular Biology Training T32 Grant an der Washington University, St. Louis, unterstützt.
Materials
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | NC0179595 | 10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C |
| 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) | Sigma Aldrich | I7125-5G | MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C |
| Anti-BrdU antibody | BD Biosciences | 347580 | Storage: Store in 4 °C |
| Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody | Thermo Scientific | A32766 | Light sensitive – keep in dark Storage: Store in 4 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G | Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C |
| Circular Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| NIS GA3 Software | Nikon | 77010604 | |
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma Aldrich | P4832-50ML | Storage: Store in 4 °C |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Thermo Scientific | P36962 | Storage: Store in 4 °C |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Genesee Scientific | 25-510 | Storage: Store in 4 °C |
| Water, sterile-filtered | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | Storage: Store in 4 °C |
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