一本鎖DNA免疫蛍光法を用いた卵巣癌細胞の複製ストレスの定量化(英語)
Summary
ここでは、細胞内の一本鎖DNAのレベルを定量するための免疫蛍光ベースの方法について説明します。この効率的で再現性のある方法は、いくつかの卵巣癌に共通する特徴である複製ストレスを調べるために利用できます。さらに、このアッセイは自動分析パイプラインと互換性があり、効率がさらに向上します。
Abstract
複製ストレスは、いくつかの卵巣癌の特徴です。複製ストレスは、二本鎖切断、転写複製の競合、増幅された癌遺伝子など、複数のソースから発生する可能性があり、必然的に一本鎖DNA(ssDNA)が生成されます。したがって、ssDNAを定量することは、さまざまな細胞タイプおよびさまざまなDNA損傷条件または治療下での複製ストレスのレベルを評価する機会を提供します。新たな証拠はまた、ssDNAがDNA修復を標的とする化学療法薬に対する反応の予測因子になり得ることを示唆している。ここでは、ssDNAを定量するための詳細な免疫蛍光ベースの方法論について説明します。この方法論では、ゲノムをチミジン類似体で標識し、続いて非変性条件下でクロマチンで類似体を抗体ベースで検出します。ssDNAのストレッチは、蛍光顕微鏡下で病巣として視覚化できます。病巣の数と強度は、核内に存在するssDNAのレベルと直接相関しています。また、ssDNAシグナルを定量するための自動パイプラインについても説明します。この方法は迅速かつ再現性があります。さらに、この方法論の単純さは、薬物および遺伝子スクリーニングなどのハイスループットアプリケーションに適しています。
Introduction
ゲノムDNAは、さまざまな内因性および外因性のソースからの複数の攻撃に頻繁にさらされます1。内因性損傷の頻度は、卵巣がんを含む複数のがんタイプで本質的に高い活性酸素種やアルデヒドなどの代謝副産物のレベルと直接相関しています2,3。DNA損傷を効率的に解決することが不可欠です。そうでなければ、遺伝毒性病変を促進し、その結果、突然変異誘発を促進する可能性があります。遺伝毒性病変を修復する細胞の能力は、エラーのないDNA修復経路の機能およびDNA損傷に応答する細胞周期進行の効率的な調節に依存しています。特に、多くの卵巣癌はp53の機能的に不活性化する変異を持っているため、欠陥のあるG1 / Sチェックポイントがあり、修復されていないゲノム病変が存在するにもかかわらず、細胞がDNA複製を開始するように導きます4,5。卵巣癌におけるDNA損傷の程度は、高悪性度漿液性卵巣癌(HGSOC)の50%以上が、エラーのないDNA修復経路であるBRCA1およびBRCA2を介した相同組換えに欠陥があり、約20%が遺伝子CCNE1に増幅があり、G1細胞を時期尚早にS期に押し込むという観察によってさらに悪化します6.内因性DNA損傷の高頻度、欠陥チェックポイント、および機能不全の修復経路が一緒になって、卵巣癌におけるゲノム病変の蓄積を指数関数的に増強します。これらの病変は、DNA複製や転写などの重要な細胞プロセスの進行に対する障害となる可能性があります。以下で論じるように、このような障害は、細胞における一本鎖DNA(ssDNA)の生成を触媒する。
DNAの二重らせんは、自発的な脱プリン化や脱ピリミジン化、シトシンデアミナーゼの活性、酸化的DNA損傷など、複数の変異原性プロセスからゲノムを保護するために重要です1,7。対照的に、ssDNAはこれらの突然変異イベントに対して非常に脆弱です。細胞内の複数のプロセスにより、ssDNAが生成される可能性があります(図1)。これらには以下が含まれます。
(i)DNA複製機構の失速:これにより、DNAヘリカーゼとポリメラーゼが脱共役し、ssDNAのストレッチが残ります8,9。
(ii)転写機構の失速:RNAポリメラーゼの持続的な失速は、Rループと呼ばれる3本鎖ハイブリッドDNA/RNA構造の生成につながります。Rループ形成は、置換された非転写DNAを一本鎖10として露出させる。
(iii)DNA終末切除:相同性指向修復の開始には、相同配列の検索を触媒するための3’ssDNAの生成が必要です11。
(iv)Dループ:相同組換え中の鎖侵入は、非テンプレート相補鎖の置換をもたらし、ssDNA12をもたらす可能性がある。
(v)複製共役ギャップ:DNA複製中、遅れ鎖合成は不連続に起こり、それによって岡崎断片が最初に生成され、次にライゲーションされる。岡崎フラグメントの処理の遅延または欠陥も、ssDNA形成につながる可能性があります。最後に、先頭鎖の複製フォークが失速病変、DNAポリメラーゼ、およびプリマーゼに遭遇した場合、PRIPOLは下流で合成を再プライミングし、ssDNAギャップを13,14の後ろに残すことができます。
明らかに、これらのイベントのほとんどは、DNA複製機構がゲノム病変に直面したとき、または複製結合修復中に発生し、DNA損傷が高いほどssDNAのレベルが上昇することを示唆しています。これらの事象の多くは複製に関連しているため、ssDNAの形成は細胞15,16における「複製ストレス」のマーカーと考えられる。
ここでは、細胞内のssDNAを確実に定量するために使用できるアッセイについて説明します。このアプローチの単純さ、再現性、およびコスト上の利点により、細胞内の複製ストレス応答の評価に使用できます。新たな研究では、ssDNAのレベルが、PARP1 / 2酵素、ATR、およびWee1キナーゼ17、18、19、20、21の阻害剤などの化学療法に対する反応の予測因子にもなり得ることが明らかになりました。これらの阻害剤は、いくつかのHGSOCs22の治療レジメンにおいて追求されている。したがって、このアッセイは、卵巣癌細胞における化学療法応答を予測するための有用なツールにもなり得る。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルで述べたように、アッセイが機能していることを確認するために、いくつかの実験的コントロールを含めることは価値があります。これらには、IdU処理されていないサンプルと一次抗体処理されていないサンプルが含まれます。両方のネガティブコントロールは、DAPIによって染色されているがIdUシグナルを含まない細胞を生成する必要があります。
実験条件?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PVは、バーンズ・ユダヤ病院財団を通じたアルビン・J・サイトマンがんセンターによる就任ペダル・ザ・コーズ助成金、マーシャ・リブキン卵巣がん研究センターからのパイロット研究助成金、メアリー・ケイ・アッシュ財団およびV財団からのがん研究助成金によってサポートされています。NRは、セントルイスのワシントン大学へのNIH細胞および分子生物学トレーニングT32助成金によってサポートされています。
Materials
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | NC0179595 | 10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C |
| 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) | Sigma Aldrich | I7125-5G | MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C |
| Anti-BrdU antibody | BD Biosciences | 347580 | Storage: Store in 4 °C |
| Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody | Thermo Scientific | A32766 | Light sensitive – keep in dark Storage: Store in 4 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G | Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C |
| Circular Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| NIS GA3 Software | Nikon | 77010604 | |
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma Aldrich | P4832-50ML | Storage: Store in 4 °C |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Thermo Scientific | P36962 | Storage: Store in 4 °C |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Genesee Scientific | 25-510 | Storage: Store in 4 °C |
| Water, sterile-filtered | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | Storage: Store in 4 °C |
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