Quantificando o estresse de replicação em células de câncer de ovário usando imunofluorescência de DNA de fita simples

Summary

Aqui, descrevemos um método baseado em imunofluorescência para quantificar os níveis de DNA de fita simples nas células. Este método eficiente e reprodutível pode ser utilizado para examinar o estresse de replicação, uma característica comum em vários tipos de câncer de ovário. Além disso, este ensaio é compatível com um pipeline de análise automatizado, o que aumenta ainda mais a sua eficiência.

Abstract

O estresse de replicação é uma característica de vários cânceres de ovário. O estresse de replicação pode emergir de várias fontes, incluindo quebras de fita dupla, conflitos de transcrição-replicação ou oncogenes amplificados, resultando inevitavelmente na geração de DNA de fita simples (ssDNA). A quantificação do ssDNA, portanto, apresenta uma oportunidade para avaliar o nível de estresse de replicação em diferentes tipos de células e sob várias condições ou tratamentos prejudiciais ao DNA. Evidências emergentes também sugerem que o ssDNA pode ser um preditor de respostas a drogas quimioterápicas que visam o reparo do DNA. Aqui, descrevemos uma metodologia detalhada baseada em imunofluorescência para quantificar o ssDNA. Esta metodologia envolve a marcação do genoma com um análogo da timidina, seguido pela detecção baseada em anticorpos do análogo na cromatina em condições não desnaturantes. Alongamentos de ssDNA podem ser visualizados como focos sob um microscópio de fluorescência. O número e a intensidade dos focos co-relacionam-se diretamente com o nível de ssDNA presente no núcleo. Também descrevemos um pipeline automatizado para quantificar o sinal de ssDNA. O método é rápido e reprodutível. Além disso, a simplicidade dessa metodologia a torna passível de aplicações de alto rendimento, como telas genéticas e de medicamentos.

Introduction

O DNA genômico é frequentemente exposto a múltiplos ataques de várias fontes endógenas e exógenas¹. A frequência de dano endógeno correlaciona-se diretamente com os níveis de subprodutos metabólicos, como espécies reativas de oxigênio ou aldeídos, que são intrinsecamente maiores em vários tipos de câncer, incluindo o câncer de ovário ^2,3. É imperativo que os danos ao ADN sejam eficazmente resolvidos; caso contrário, pode promover lesões genotóxicas e, consequentemente, mutagênese. A capacidade das células de reparar lesões genotóxicas depende da funcionalidade das vias de reparo do DNA livres de erros e da regulação eficiente da progressão do ciclo celular em resposta a danos no DNA. Notavelmente, muitos cânceres de ovário apresentam mutações funcionalmente inativadoras na p53 e, portanto, têm um ponto de verificação G1/S defeituoso, levando as células a iniciar a replicação do DNA, apesar da presença de lesões genômicas não reparadas ^4,5. O grau de dano ao DNA em cânceres de ovário é ainda agravado pela observação de que mais de 50% do carcinoma seroso de ovário de alto grau (HGSOC) tem defeitos na recombinação homóloga mediada por BRCA1 e BRCA2, a via de reparo de DNA livre de erros, e cerca de 20% têm amplificação no gene CCNE1, que prematuramente empurra as células G1 para a fase S⁶ . Juntas, a alta frequência de danos endógenos ao DNA, pontos de verificação defeituosos e vias de reparo com defeito aumentam exponencialmente o acúmulo de lesões genômicas em cânceres de ovário. Essas lesões podem servir como impedimentos para a progressão de processos celulares críticos, como replicação e transcrição do DNA. Como discutido abaixo, tais impedimentos catalisam a geração de DNA de fita simples (ssDNA) nas células.

A dupla hélice do DNA é fundamental para proteger o genoma de múltiplos processos mutagênicos, como a depurinação espontânea e a despirimidinação, a atividade das citosinas desaminadas e o dano oxidativo ao DNA ^1,7. Em contraste, o ssDNA é altamente vulnerável a esses eventos mutacionais. Múltiplos processos nas células podem resultar na geração de ssDNA (Figura 1). Estes incluem o seguinte:

(i) Estagnação da máquina de replicação do DNA: Isso leva a um desacoplamento da helicase de DNA e da polimerase, deixando trechos de ssDNA ^8,9.

(ii) Estagnação da maquinaria de transcrição: A estagnação persistente da RNA polimerase leva à geração de estruturas híbridas de DNA/RNA de três fitas chamadas R-loops. A formação da alça R expõe o DNA deslocado e não transcrito como uma única fita¹⁰.

(iii) Ressecção final de DNA: O início do reparo dirigido por homologia requer a geração de um ssDNA 3′ para catalisar a busca de uma sequência homóloga¹¹.

(iv) D-loop: A invasão da fita durante a recombinação homóloga pode resultar no deslocamento da fita complementar não molde, resultando em ssDNA¹².

(v) Lacunas acopladas à replicação: Durante a replicação do DNA, a síntese de fitas atrasadas acontece de forma descontínua, em que os fragmentos de Okazaki são primeiro gerados e depois ligados. Um atraso ou defeito no processamento dos fragmentos de Okazaki também pode resultar na formação de ssDNA. Finalmente, se o garfo de replicação em uma fita principal encontrar uma lesão estagnada, DNA polimerase e primase, o PRIMPOL pode refazer a síntese a jusante, deixando uma lacuna de ssDNA atrás^{de 13,14}.

Evidentemente, a maioria desses eventos acontece quando a maquinaria de replicação do DNA enfrenta lesões genômicas ou durante o reparo acoplado à replicação, sugerindo que maiores danos ao DNA levam ao aumento dos níveis de ssDNA. Como muitos desses eventos estão associados à replicação, a formação de ssDNA é considerada o marcador de “estresse de replicação” nas células^15,16.

Aqui, descrevemos um ensaio que pode ser usado para quantificar de forma confiável o ssDNA nas células. A simplicidade, a reprodutibilidade e os benefícios de custo dessa abordagem a tornam passível de ser usada para avaliar a resposta de replicação e estresse nas células. Estudos emergentes têm revelado que o nível de ssDNA também pode ser um preditor de respostas à quimioterapia, como inibidores das enzimas PARP1/2, ATR e Wee1 quinase 17,18,19,20,21. Esses inibidores estão sendo perseguidos no regime de tratamento de vários HGSOCs²². Portanto, este ensaio também pode ser uma ferramenta útil para prever respostas quimioterápicas em células de câncer de ovário.

Protocol

NOTA: A linhagem celular de câncer de ovário, OVCAR3, foi usada nessas etapas, mas este protocolo é amplamente aplicável a várias outras linhagens celulares, incluindo aquelas derivadas de fontes não ovarianas. Um esquema do protocolo é mostrado na Figura 2. 1. Planear as células Faça tampas revestidas com poli-L-lisina.Adicione as coberturas autoclavadas de 12 mm de diâmetro a um tubo cônico de 50 mL com solução de …

Representative Results

Imagens representativas e a quantificação de focos de IdU dos núcleos derivados das células não tratadas e células tratadas com hidroxiureia 0,5 mM por 24 h são mostradas na Figura 4. Ambos os núcleos são corados e identificáveis no canal DAPI. A análise dessas imagens consiste em quantificar o número de focos em cada núcleo. O número de focos é proporcional ao grau de estresse de replicação. <img alt="Fi…

Discussion

Como foi mencionado no protocolo, é valioso incluir alguns controles experimentais para garantir que o ensaio esteja funcionando. Estes incluem uma amostra sem tratamento com IdU, bem como uma amostra sem tratamento com anticorpos primários. Ambos os controles negativos devem produzir células que são coradas por DAPI, mas não contêm sinal de IdU.

Com base nas condições experimentais e linhagens celulares utilizadas, diferentes diluições de anticorpos podem ser necessárias para obter…

Materials

3% Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	NC0179595	10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C
5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C
Anti-BrdU antibody	BD Biosciences	347580	Storage: Store in 4 °C
Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody	Thermo Scientific	A32766	Light sensitive – keep in dark Storage: Store in 4 °C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C
Circular Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72230-01
NIS GA3 Software	Nikon	77010604
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C
Poly-L-Lysine solution	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Storage: Store in 4 °C
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI	Thermo Scientific	P36962	Storage: Store in 4 °C
Trypsin-EDTA, 0.25%	Genesee Scientific	25-510	Storage: Store in 4 °C
Water, sterile-filtered	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Storage: Store in 4 °C