एकल-फंसे डीएनए इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं में प्रतिकृति तनाव की मात्रा

Summary

यहां, हम कोशिकाओं में एकल-फंसे डीएनए के स्तर को निर्धारित करने के लिए एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस-आधारित विधि का वर्णन करते हैं। इस कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का उपयोग प्रतिकृति तनाव की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जो कई डिम्बग्रंथि के कैंसर में एक आम विशेषता है। इसके अतिरिक्त, यह परख एक स्वचालित विश्लेषण पाइपलाइन के साथ संगत है, जो इसकी दक्षता को और बढ़ाती है।

Abstract

प्रतिकृति तनाव कई डिम्बग्रंथि के कैंसर की पहचान है। प्रतिकृति तनाव कई स्रोतों से उभर सकता है, जिसमें डबल-स्ट्रैंड ब्रेक, प्रतिलेखन-प्रतिकृति संघर्ष, या प्रवर्धित ऑन्कोजीन शामिल हैं, जिसके परिणामस्वरूप अनिवार्य रूप से एकल-फंसे हुए डीएनए (एसएसडीएनए) की पीढ़ी होती है। इसलिए, एसएसडीएनए की मात्रा, विभिन्न सेल प्रकारों में और विभिन्न डीएनए-हानिकारक स्थितियों या उपचारों के तहत प्रतिकृति तनाव के स्तर का आकलन करने का अवसर प्रस्तुत करती है। उभरते सबूत यह भी बताते हैं कि एसएसडीएनए डीएनए की मरम्मत को लक्षित करने वाली कीमोथेरेपी दवाओं की प्रतिक्रियाओं का एक भविष्यवक्ता हो सकता है। यहां, हम एसएसडीएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विस्तृत इम्यूनोफ्लोरेसेंस-आधारित पद्धति का वर्णन करते हैं। इस पद्धति में जीनोम को थाइमिडीन एनालॉग के साथ लेबल करना शामिल है, इसके बाद गैर-विकृत परिस्थितियों में क्रोमैटिन में एनालॉग का एंटीबॉडी-आधारित पता लगाना शामिल है। एसएसडीएनए के हिस्सों को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत फॉसी के रूप में देखा जा सकता है। फॉसी की संख्या और तीव्रता सीधे नाभिक में मौजूद एसएसडीएनए के स्तर के साथ सह-संबंधित है। हम एसएसडीएनए सिग्नल को मापने के लिए एक स्वचालित पाइपलाइन का भी वर्णन करते हैं। विधि तेजी से और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। इसके अलावा, इस पद्धति की सादगी इसे दवा और आनुवंशिक स्क्रीन जैसे उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए उत्तरदायी बनाती है।

Introduction

जीनोमिक डीएनए अक्सर विभिन्न अंतर्जात और बहिर्जात स्रोतों से कई हमलों के संपर्क^{में आता} है। अंतर्जात क्षति की आवृत्ति सीधे चयापचय उपोत्पादों के स्तर से संबंधित है, जैसे कि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां या एल्डिहाइड, जो डिम्बग्रंथि के कैंसर सहित कई कैंसर^{प्रकारों} में आंतरिक रूप से अधिक ^हैं। यह जरूरी है कि डीएनए क्षति को कुशलतापूर्वक हल किया जाए; अन्यथा, यह जीनोटॉक्सिक घावों को बढ़ावा दे सकता है और, परिणामस्वरूप, म्यूटेनेसिस। जीनोटॉक्सिक घावों की मरम्मत करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता त्रुटि-मुक्त डीएनए मरम्मत मार्गों की कार्यक्षमता और डीएनए क्षति के जवाब में सेल चक्र प्रगति के कुशल विनियमन पर निर्भर है। विशेष रूप से, कई डिम्बग्रंथि के कैंसर पी 53 में कार्यात्मक रूप से निष्क्रिय उत्परिवर्तन को सहन करते हैं और इस प्रकार, एक दोषपूर्ण जी 1 / एस चेकपॉइंट होता है, जिससे कोशिकाओं को अप्रकाशित जीनोमिक घावों^की उपस्थिति के बावजूद डीएनए प्रतिकृति शुरू करने के लिए प्रेरित किया ^{जाता है।} डिम्बग्रंथि के कैंसर में डीएनए क्षति की डिग्री इस अवलोकन से और बढ़ जाती है कि उच्च श्रेणी के सीरस डिम्बग्रंथि कार्सिनोमा (एचजीएसओसी) के 50% से अधिक में बीआरसीए 1- और बीआरसीए 2-मध्यस्थता वाले समरूप पुनर्संयोजन, त्रुटि-मुक्त डीएनए मरम्मत मार्ग में दोष होते हैं, और लगभग 20% में जीन सीसीएनई 1 में प्रवर्धन होता है, जो समय से पहले जी 1 कोशिकाओं को एस-चरण⁶ में धकेल देता है . साथ में अंतर्जात डीएनए क्षति की उच्च आवृत्ति, दोषपूर्ण चौकियों, और खराब मरम्मत मार्गों ने डिम्बग्रंथि के कैंसर में जीनोमिक घावों के संचय को तेजी से बढ़ाया है। ये घाव डीएनए प्रतिकृति और प्रतिलेखन जैसी महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं की प्रगति के लिए बाधाओं के रूप में काम कर सकते हैं। जैसा कि नीचे चर्चा की गई है, इस तरह की बाधाएं कोशिकाओं में एकल-फंसे डीएनए (एसएसडीएनए) की पीढ़ी को उत्प्रेरित करती हैं।

डीएनए का डबल हेलिक्स जीनोम को कई म्यूटाजेनिक प्रक्रियाओं से बचाने के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे कि सहज डीप्यूरिनेशन और डिपिरिमिडिनेशन, साइटोसिन डिमिनेस की गतिविधि, और ऑक्सीडेटिव डीएनए क्षति ^1,7। इसके विपरीत, एसएसडीएनए इन उत्परिवर्तन घटनाओं के लिए अत्यधिक संवेदनशील है। कोशिकाओं में कई प्रक्रियाओं के परिणामस्वरूप एसएसडीएनए (चित्रा 1) की पीढ़ी हो सकती है। इनमें निम्नलिखित शामिल हैं:

(i) डीएनए प्रतिकृति मशीनरी का ठप होना: इससे डीएनए हेलिकेस और पोलीमरेज़ का एक संयोजन होता है, जिससे एसएसडीएनए ^8,9 के खंड छूट ^जाते हैं।

(ii) प्रतिलेखन मशीनरी का रुकना: आरएनए पोलीमरेज़ के लगातार रुकने से तीन-फंसे हुए हाइब्रिड डीएनए/आरएनए संरचनाओं का निर्माण होता है जिन्हें आर-लूप कहा जाता है। आर-लूप गठन विस्थापित, गैर-स्थानांतरित डीएनए को एकल स्ट्रैंड¹⁰ के रूप में उजागर करता है।

(iii) डीएनए एंड-रिसेक्शन: होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत की शुरुआत के लिए एक समरूप अनुक्रम¹¹ की खोज को उत्प्रेरित करने के लिए 3’एसएसडीएनए की पीढ़ी की आवश्यकता होती है।

(iv) डी-लूप: समरूप पुनर्संयोजन के दौरान स्ट्रैंड आक्रमण के परिणामस्वरूप गैर-टेम्पलेट पूरक स्ट्रैंड का विस्थापन हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप एसएसडीएनए¹² हो सकता है।

(v) प्रतिकृति-युग्मित अंतराल: डीएनए प्रतिकृति के दौरान, लैगिंग स्ट्रैंड संश्लेषण एक असंतुलित तरीके से होता है, जिससे ओकाजाकी टुकड़े पहले उत्पन्न होते हैं और फिर लिगेट होते हैं। ओकाजाकी टुकड़ों को संसाधित करने में देरी या दोष के परिणामस्वरूप एसएसडीएनए का गठन भी हो सकता है। अंत में, यदि एक प्रमुख स्ट्रैंड पर प्रतिकृति कांटा एक रुकने वाले घाव, डीएनए पोलीमरेज़ और प्राइमाज़ का सामना करता है, तो PRIMPOL संश्लेषण को डाउनस्ट्रीम में पुन: प्राप्त कर सकता है, जिससे^{एसएसडीएनए अंतर 13,14} पीछे रह ^जाता है।

जाहिर है, इनमें से अधिकांश घटनाएं या तो तब होती हैं जब डीएनए प्रतिकृति मशीनरी जीनोमिक घावों का सामना करती है या प्रतिकृति-युग्मित मरम्मत के दौरान, यह सुझाव देती है कि उच्च डीएनए क्षति से एसएसडीएनए के स्तर में वृद्धि होती है। चूंकि इनमें से कई घटनाएं प्रतिकृति से जुड़ी हैं, एसएसडीएनए के गठन को कोशिकाओं^15,16 में “प्रतिकृति तनाव” का मार्कर माना जाता है।

यहां, हम एक परख का वर्णन करते हैं जिसका उपयोग कोशिकाओं में एसएसडीएनए को मज़बूती से निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण की सादगी, प्रजनन क्षमता और लागत लाभ कोशिकाओं में प्रतिकृति-तनाव प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए उपयोग किए जाने योग्य बनाते हैं। उभरते अध्ययनों से पता चला है कि एसएसडीएनए का स्तर कीमोथेरेपी के लिए प्रतिक्रियाओं का एक भविष्यवक्ता भी हो सकता है, जैसे कि पीएआरपी 1/2 एंजाइम, एटीआर, और वी 1 किनेज 17,18,19,20,21 के अवरोधक। इन अवरोधकों को कई एचजीएसओसी²² के उपचार आहार में पीछा किया जा रहा है। इसलिए, यह परख डिम्बग्रंथि के कैंसर कोशिकाओं में कीमोथेरेपी प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी करने के लिए एक उपयोगी उपकरण भी हो सकता है।

Protocol

नोट: डिम्बग्रंथि के कैंसर सेल लाइन, OVCAR3, का उपयोग इन चरणों में किया गया था, लेकिन यह प्रोटोकॉल व्यापक रूप से कई अन्य सेल लाइनों पर लागू होता है, जिसमें गैर-डिम्बग्रंथि स्रोतों से प्राप्त भी शामिल हैं। प्रो…

Representative Results

अनुपचारित कोशिकाओं और कोशिकाओं से प्राप्त नाभिक से आईडीयू फॉसी की प्रतिनिधि छवियों और 24 घंटे के लिए 0.5 एमएम हाइड्रॉक्सीयूरिया के साथ इलाज की गई कोशिकाओं को चित्रा 4 में दिखाया गया है। दोनों ?…

Discussion

जैसा कि प्रोटोकॉल में उल्लेख किया गया था, यह सुनिश्चित करने के लिए कुछ प्रयोगात्मक नियंत्रणों को शामिल करना मूल्यवान है कि परख काम कर रही है। इनमें कोई आईडीयू उपचारित नमूना और साथ ही कोई प्राथमिक एंटी?…

Materials

3% Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	NC0179595	10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C
5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C
Anti-BrdU antibody	BD Biosciences	347580	Storage: Store in 4 °C
Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody	Thermo Scientific	A32766	Light sensitive – keep in dark Storage: Store in 4 °C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C
Circular Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72230-01
NIS GA3 Software	Nikon	77010604
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C
Poly-L-Lysine solution	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Storage: Store in 4 °C
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI	Thermo Scientific	P36962	Storage: Store in 4 °C
Trypsin-EDTA, 0.25%	Genesee Scientific	25-510	Storage: Store in 4 °C
Water, sterile-filtered	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Storage: Store in 4 °C