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Biology

소변에서 유래한 영장류 유도 만능줄기세포의 생성 및 유지

Published: July 28, 2023
doi:
10.3791/64922
, , , ,
1Faculty of Biology,Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for the Advanced Study of Human Biology,Kyoto University, 3Hakubi Center,Kyoto University

Summary

본 프로토콜은 인간 및 비인간 영장류 소변 유래 세포를 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로 분리, 확장 및 재프로그래밍하는 방법과 새로 생성된 iPSC의 피더 없는 유지 관리에 대한 지침을 설명합니다.

Abstract

영장류 만능 줄기 세포와 그 유도체를 연구하는 종 간 접근법은 질병, 발달 및 진화의 분자 및 세포 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 영장류 유도만능줄기세포(iPSC)에 보다 쉽게 접근할 수 있도록 하기 위해 본 논문에서는 소변 유래 세포에서 인간 및 비인간 영장류 iPSC를 생성하는 비침습적 방법과 피더 프리 배양 방법을 사용한 유지 관리를 제시합니다.

소변은 비멸균 환경(예: 동물의 케이지)에서 샘플링하고 1차 세포 배양 중에 광범위한 항생제 칵테일로 처리하여 오염을 효율적으로 줄일 수 있습니다. 소변 유래 세포의 증식 후, iPSC는 상업적으로 이용 가능한 센다이 바이러스 벡터 시스템의 변형된 형질도입 방법에 의해 생성됩니다. 첫 번째 iPSC 콜로니는 이미 5일 후에 볼 수 있으며 빠르면 10일 후에 채취할 수 있습니다. 효소가 없는 해리 완충액을 사용한 일상적인 덩어리 계대배양은 50개 이상의 계대에 대해 생성된 iPSC의 다능성을 지원합니다.

Introduction

인간과 비인간 영장류(NHP)의 게놈 비교는 우리의 진화 역사와 인간 특이적 형질의 진화를 이해하는 데 중요합니다1. 추가적으로, 이러한 비교는 보존된 DNA 서열2을 식별함으로써, 예를 들어, 질병 관련 변이체3의 우선순위를 정함으로써 기능의 추론을 가능하게한다. 유전자 발현 수준과 같은 분자 표현형의 비교는 게놈 비교를 더 잘 해석하고 예를 들어 세포 표현형 차이를 발견하는 데 중요합니다. 또한, DNA 수준에서의 비교와 유사하게 기능적 관련성을 추론할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 따라서 인간 내에서 의학적으로 관련된 변이를 더 잘 해석할 수 있다4. 이러한 비교 연구에 포괄적인 분자 표현형 데이터를 통합하려면 적절한 생물학적 자원(즉, 종 전반에 걸친 상동 세포)이 필요합니다. 그러나 윤리적이고 실용적인 이유로 인해 특히 개발 중에 이러한 유사한 세포에 접근하는 것이 어렵거나 불가능합니다. 유도만능줄기세포(iPSCs)는 시험관 내에서 접근하기 어려운 세포 유형의 생성을 가능하게 하고5,6, 실험적으로 접근가능하며, 영장류 비교에 사용되어 왔다6,7,8,9,10,11,12,13,14.

iPSC를 생성하려면 다시 프로그래밍할 1차 셀을 획득해야 합니다. 소변에서 분리된 세포는 영장류로부터 비침습적으로 샘플링할 수 있고, 줄기세포와 유사한 분자 프로파일로 인해 쉽게 재프로그래밍할 수 있다는 장점이 있다15. 영장류 iPSC를 유지하기 위한 배양 조건은 재프로그래밍만큼 중요합니다. 일반적으로 인간 만능 줄기 세포의 배양에는 필수 영양소와 배아 줄기 세포(ESC)를 위한 스캐폴드를 제공하는 정의되지 않은 혈청 기반 배지와 마우스 배아 섬유아세포(소위 영양세포)의 공동 배양이 필요했습니다16. 화학적으로 정의되고 피더가 없는 배양 시스템(17,18)의 개발 이후, 현재 상업적으로 이용 가능한 iPSC 배양 배지 및 매트릭스의 다양한 옵션이 있습니다. 그러나 이러한 배양 조건의 대부분은 인간 ESC 및 iPSC에 최적화되어 있으므로 NHP iPSC 배양에서는 잘 작동하지 않을 수 있습니다. 이 비디오 프로토콜에서는 소변 세포 배양에서 파생된 인간 및 NHP iPSC를 생성하고 유지하기 위한 지침을 제공합니다.

2006년 섬유아세포에서 정의된 인자의 강제 발현에 의한 iPSC 생성이 처음 보고된 이후, 이 방법은 다양한 기원의 다양한 세포 유형에 적용되었습니다 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. 그 중에서도 소변 유래 세포만 완전히 비침습적으로 얻을 수 있습니다. 앞서 기술한 Zhou et al.33의 프로토콜에 따르면, 광범위한 항생제를 보충함으로써 비멸균 샘플에서도 영장류의 소변에서 세포를 분리하고 확장할 수 있다15. 특히, 이 프로토콜에 의해 샘플링된 소변 유래 세포는 섬유아세포의 기존 재프로그래밍(20-30일, 우리의 경험에서)보다 더 짧은 기간(콜로니가 5-15일 후에 볼 수 있음) 내에 iPSC를 생성할 수 있는 높은 잠재력을 나타내며 충분히 높은 성공률로 나타납니다. 이러한 소변 유래 세포는 중간엽 줄기세포 유사 세포와 방광 상피 세포의 혼합 집단으로 분류되어 높은 재프로그래밍 효율을 일으켰다(15).

1차 셀의 변화 외에도 iPSC를 생성하는 재프로그래밍 방법도 사용 목적에 따라 다릅니다. 인간 체세포에 대한 종래의 재프로그래밍 절차는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터를 이용한 재프로그래밍 인자의 과발현에 의해 수행되었으며, 이는 게놈 5,34,35에서 외인성 DNA의 통합을 허용하였다. 생성된 iPSC를 게놈적으로 온전하게 유지하기 위해 연구자들은 절제 가능한 PiggyBac 벡터 36,37, 에피솜 벡터38,39, 센다이 바이러스 40 및 아데노바이러스 41과 같은 비통합 바이러스 벡터, mRNA 형질감염 42, 단백질 형질감염 43,44 및 화학 화합물 처리 45. 효율성과 취급 용이성으로 인해 센다이 바이러스 기반 재프로그래밍 벡터가 이 프로토콜에 사용됩니다. 일차 세포의 감염은 플레이팅 전에 5의 감염 다중도(MOI)에서 세포 및 바이러스의 1시간 현탁 배양에서 수행됩니다. 이 변형된 단계는 바이러스가 부착된 세포 배양물에 직접 첨가되는 종래의 방법에 비해 세포 표면과 바이러스 사이의 접촉 가능성을 증가시킬 수 있으며, 따라서 더 많은 iPSC 콜로니를 생성할 수 있다15.

인간 및 NHP 만능 줄기 세포의 계대는 덩어리 계대증 및 단세포 계대증에 의해 수행될 수 있습니다. 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)은 칼슘과 마그네슘 이온을 결합하여 카데린과 인테그린의 부착 활성을 방지하는 비용 효율적인 킬레이트제입니다. EDTA는 또한 미분화 세포가 다른 접착 분자로 인해 분화 된 세포보다 먼저 분리되기 때문에 온화하고 선택적인 해리 시약으로 사용됩니다. 완전한 해리는 단백질 키나아제(Rho/Rock) 매개 미오신 과활성화를 포함하는 Rho/Rho 관련 코일 코일을 통해 영장류 iPSC의 대규모 세포 사멸을 유도합니다. 따라서 배양 배지에 Rho/Rock 억제제를 보충하는 것은 현탁액46,47의 단일 세포가 필요한 실험에 필수적입니다. 이 프로토콜에서는 일상적인 패시징 방법으로 덩어리 패시징을 권장하고 정의된 셀 번호의 시딩이 필요한 경우 또는 하위 클로닝 중에 필요한 경우에만 단일 셀 패시징을 권장합니다.

Protocol

이 실험 절차는 인간 실험에 대한 책임 윤리 위원회(20-122, Ethikkommission LMU München)의 승인을 받았습니다. 모든 실험은 관련 지침 및 규정에 따라 수행되었다.참고: 인간 및 NHP 샘플을 다루는 실험을 시작하기 전에 적절한 윤리 위원회의 승인을 받아야 합니다. 모든 실험 절차는 관련 지침 및 규정에 따라 수행되어야 합니다. 다음 각 단계는 생물학적 안전 캐비닛에서 멸균 기술을 사용하여 수행해?…

Representative Results

인간 및 NHP 소변에서 세포를 분리할 때 분리 직후 다양한 유형의 세포를 식별할 수 있습니다. 편평 세포와 다양한 작은 원형 세포가 소변과 함께 배설됩니다. 여성의 소변은 남성의 소변보다 훨씬 더 많은 편평 세포를 함유하고 있습니다(그림 1B – 0일; 보충 그림 S1). 1차 소변 배지에서 5일 동안 배양한 후 첫 번째 부착성 증식 세포를 볼 수 있습니다(<strong class="xfig…

Discussion

iPSC는 시험관 내에서 접근할 수 없는 세포 유형을 생성할 수 있기 때문에 가치 있는 세포 유형입니다. 재프로그래밍을 위한 출발 물질로서, 예를 들어, 섬유아세포는 모든 영장류 종에서 쉽게 구할 수 있는 것은 아니지만, 이 논문은 소변 유래 세포에서 iPSC를 생성하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 세포는 배양 배지에 광범위한 항생제를 보충하여 비멸균 영장류 소변 샘플에서도 비?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 DFG EN 1093/5-1(프로젝트 번호 458247426)의 지원을 받았습니다. M.O.는 JSPS Overseas Research Fellowship의 지원을 받았습니다. 모든 피규어는 BioRender.com 로 만들어졌습니다. 유세포 분석은 뮌헨 생물 의학 센터의 핵심 시설 유세포 분석의 도움으로 수행되었습니다. 비디오 촬영을 지원해 주신 교토 대학 ASHBi의 Makoto Shida와 Tomoyo Muto에게 감사드립니다.

Materials

Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) Sigma-Aldrich SCR006
Amphotericin B-Solution Merck A2941-100ML
Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody  Stem Cell Technologies 60064 Dilution: 1/200
Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody  Miltenyi Biotec 130-122-965 Dilution: 1/50
Bambanker™ (Cell freezing medium) Nippon Genetics BB01
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059-100G
Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR Greiner BIO-ONE 665180
Countess™ II automated cell counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) Sued-Laborbedarf 52 95-0213 Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information.
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) Thermo Fisher Scientific A16519
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) Thermo Fisher Scientific A16518
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride Sigma-Aldrich 10236276001
DMEM High Glucose TH.Geyer L0102
DMEM/F12 w L-glutamine Fisher Scientific 15373541
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 Thermo Fisher Scientific A-21202 Dilution: 1/500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 Thermo Fisher Scientific A-21207 Dilution: 1/500
DPBS w/o Calcium w/o Magnesium TH.Geyer L0615-500
EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) Thermo Fisher Scientific 710524 Dilution: 1/500
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Carl Roth CN06.3
Falcon Tube 15 mL conical bottom Greiner BIO-ONE 188271-N
Falcon Tube 50 mL conical bottom Greiner BIO-ONE 227261
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) Thermo Fisher Scientific 10500064
FlowJo V10.8.2 FlowJo  663441
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890-1KG
Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413301
GlutaMAX™ Supplement Thermo Fisher Scientific 35050038
Heracell™ 240i CO2 incubator Fisher Scientific 16416639
Heraeus HeraSafe safety cabinet Kendro 51017905
Human EGF, premium grade Miltenyi Biotec 130-097-749
ImageJ  Fiji Version 2.9.0
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140035
Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL Nerbe Plus 04-212-1000
Microscope Nikon eclipse TE2000-S Nikon TE2000-S
Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody R&D Systems MAB1368 Dilution: 1/100
Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody R&D Systems MAB1420 Dilution: 1/100
Mouse anti-beta-III Tubulin antibody R&D Systems MAB1195 Dilution: 1/100
mTeSR™ 1 STEMCELL Technolgies 85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb  Cell Signaling Technology 4903S Dilution: 1/400
Normocure™ (Antimicrobial Reagent) Invivogen ant-noc
Oct-4 Rabbit Antibody  Cell Signaling Technology 2750S Dilution: 1/400
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 441244-1KG
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) Thermo Fisher Scientific 15140122 Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin.
Recombinant Human FGF-basic PeproTech 100-18B
Recombinant Human PDGF-AB PeproTech 100-00AB
Refrigerated benchtop centrifuge SIGMA  4-16KS
Renal Epithelial Cell Basal Medium ATCC PCS-400-030
Renal Epithelial Cell Growth Kit ATCC PCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 Cell Signaling Technology 4900S Dilution: 1/400
SSEA4 (MC813) Mouse mAb NEB 4755S Dilution: 1/500
StemFit® Basic02 Nippon Genetics 3821.00 The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead.
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-50ML
TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) Thermo Fisher Scientific 12563011
Waterbath Precision GP 05 Thermo Fisher Scientific TSGP05
Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) Biozol BYT-ORB153635
Antibody dilution buffer For composition see the supplementary table S1
Blocking buffer For composition see the supplementary table S1
REMC medium For composition see the supplementary table S1
Primary urine medium For composition see the supplementary table S1
PSC culture medium For composition see the supplementary table S1
PSC generation medium For composition see the supplementary table S1
Urine wash buffer For composition see the supplementary table S1
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References

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