Generatie en onderhoud van door primaten geïnduceerde pluripotente stamcellen afgeleid van urine
Summary
Het huidige protocol beschrijft een methode om menselijke en niet-menselijke van primaten urine-afgeleide cellen te isoleren, uit te breiden en te herprogrammeren tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s), evenals instructies voor feedervrij onderhoud van de nieuw gegenereerde iPSC’s.
Abstract
Cross-species benaderingen die primaat pluripotente stamcellen en hun derivaten bestuderen, zijn cruciaal om de moleculaire en cellulaire mechanismen van ziekte, ontwikkeling en evolutie beter te begrijpen. Om primaat geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) toegankelijker te maken, presenteert dit artikel een niet-invasieve methode om menselijke en niet-menselijke primaat iPSC’s te genereren uit urine-afgeleide cellen, en hun onderhoud met behulp van een feeder-vrije kweekmethode.
De urine kan worden bemonsterd vanuit een niet-steriele omgeving (bijvoorbeeld de kooi van het dier) en worden behandeld met een breedspectrum antibioticacocktail tijdens de primaire celkweek om besmetting efficiënt te verminderen. Na voortplanting van de van urine afgeleide cellen worden iPSC’s gegenereerd door een aangepaste transductiemethode van een in de handel verkrijgbaar Sendai-virusvectorsysteem. Eerste iPSC-kolonies kunnen al na 5 dagen zichtbaar zijn en kunnen op zijn vroegst na 10 dagen worden geplukt. Routinematige klomppassage met enzymvrije dissociatiebuffer ondersteunt de pluripotentie van de gegenereerde iPSC’s gedurende meer dan 50 passages.
Introduction
Genomische vergelijkingen van menselijke en niet-menselijke primaten (NHP’s) zijn cruciaal om onze evolutionaire geschiedenis en de evolutie van mensspecifieke eigenschappente begrijpen 1. Bovendien maken deze vergelijkingen de gevolgtrekking van functie mogelijk door geconserveerde DNA-sequenties2 te identificeren, bijvoorbeeld om prioriteit te geven aan ziektegerelateerde varianten3. Vergelijkingen van moleculaire fenotypes zoals genexpressieniveaus zijn cruciaal om genomische vergelijkingen beter te interpreteren en om bijvoorbeeld cellulaire fenotypische verschillen te ontdekken. Bovendien hebben ze – vergelijkbaar met vergelijkingen op DNA-niveau – het potentieel om functionele relevantie af te leiden, en dus om medisch relevante variatie binnen mensen beter te interpreteren4. De opname van uitgebreide moleculaire fenotypische gegevens in deze vergelijkende studies vereist geschikte biologische middelen (d.w.z. orthologe cellen tussen soorten). Ethische en praktische redenen maken het echter moeilijk of onmogelijk om toegang te krijgen tot dergelijke vergelijkbare cellen, vooral tijdens de ontwikkeling. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) maken het mogelijk om dergelijke ontoegankelijke celtypen in vitro5,6 te genereren, zijn experimenteel toegankelijk en zijn gebruikt voor primatenvergelijkingen 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Om iPSC’s te genereren, moet men de primaire cellen verwerven die opnieuw moeten worden geprogrammeerd. Cellen geïsoleerd uit urine hebben het voordeel dat ze niet-invasief kunnen worden bemonsterd van primaten en dat ze gemakkelijk kunnen worden geherprogrammeerd, waarschijnlijk vanwege hun stamcelachtige moleculaire profielen15. De kweekomstandigheden om iPSC’s van primaten in stand te houden zijn net zo belangrijk als herprogrammering; klassiek vereiste de kweek van menselijke pluripotente stamcellen een niet-gedefinieerd, op serum gebaseerd medium en co-cultuur van embryonale fibroblasten van muizen – zogenaamde feedercellen – die essentiële voedingsstoffen en een steiger voor embryonale stamcellen (SER’s) leveren16. Sinds de ontwikkeling van chemisch gedefinieerde en feedervrije kweeksystemen17,18, zijn er nu verschillende opties van commercieel verkrijgbare iPSC-kweekmedia en -matrices. De meeste van deze kweekomstandigheden zijn echter geoptimaliseerd voor menselijke SER’s en iPSC’s en werken daarom mogelijk minder goed in de NHP iPSC-cultuur. In dit videoprotocol geven we instructies voor het genereren en onderhouden van menselijke en NHP iPSC’s afgeleid van urinecelkweek.
Sinds het eerste rapport van iPSC-generatie door de geforceerde expressie van gedefinieerde factoren in fibroblasten in 2006, is deze methode toegepast op veel verschillende celtypen van verschillende oorsprong 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Onder hen kunnen alleen van urine afgeleide cellen op een volledig niet-invasieve manier worden verkregen. Op basis van het eerder beschreven protocol van Zhou et al.33 kan men cellen isoleren en uitbreiden uit de urine van primaten, zelfs uit niet-steriele monsters, door breedspectrumantibiotica aan te vullen15. Met name urine-afgeleide cellen bemonsterd door dit protocol vertonen een hoog potentieel om iPSC’s te produceren, binnen een kortere periode (kolonies worden zichtbaar in 5-15 dagen) dan de conventionele herprogrammering van fibroblasten (20-30 dagen, in onze ervaring), en met een voldoende hoog slagingspercentage. Deze van urine afgeleide cellen werden geclassificeerd als de gemengde populatie van mesenchymale stamcelachtige cellen en blaasepitheelcellen, waardoor de hoge herprogrammeringsefficiëntie werd veroorzaakt15.
Naast de variatie in primaire cellen, variëren de herprogrammeringsmethoden om iPSC’s te genereren ook afhankelijk van het doel van het gebruik. Conventionele herprogrammeringsprocedures voor menselijke somatische cellen werden uitgevoerd door de overexpressie van herprogrammeringsfactoren met retrovirus- of lentivirusvectoren, waardoor de integratie van exogene DNA in het genoom 5,34,35 mogelijk werd. Om de gegenereerde iPSC’s genomisch intact te houden, hebben onderzoekers een breed scala aan niet-integratiesystemen ontwikkeld – excisable PiggyBac-vector36,37, episomale vector38,39, niet-integrerende virusvectoren zoals Sendai-virus40 en adenovirus 41, mRNA-transfectie 42, eiwittransfectie 43,44 en behandeling met chemische verbindingen 45. Vanwege de efficiëntie en het gemak in de hantering, worden de Sendai-virusgebaseerde herprogrammeringsvectoren gebruikt in dit protocol. Infectie van primaire cellen wordt uitgevoerd in een 1 h suspensiecultuur van cellen en virussen met een multipliciteit van infectie (MOI) van 5 voorafgaand aan plating. Deze aangepaste stap zou de kans op contact tussen celoppervlakken en virussen kunnen vergroten, vergeleken met de conventionele methode waarbij de virussen rechtstreeks aan de aanhangende celcultuur worden toegevoegd en dus meer iPSC-kolonies opleveren15.
Passaging van menselijke en NHP pluripotente stamcellen kan worden gedaan door klonterpassing en eencellige passaging. Ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) is een kostenefficiënte chelaatvormer die calcium- en magnesiumionen bindt en zo de hechtende activiteit van cadherine en integrine voorkomt. EDTA wordt ook gebruikt als een mild, selectief dissociatiereagens, omdat ongedifferentieerde cellen zich losmaken voor gedifferentieerde cellen vanwege hun verschillende adhesiemoleculen. Volledige dissociatie induceert massale celdood van iPSC’s van primaten via de Rho / Rho-geassocieerde coiled coil met eiwitkinase (Rho / Rock) -gemedieerde myosinehyperactivatie. Daarom is het aanvullen van het kweekmedium met een Rho/Rock-remmer essentieel voor experimenten waarbij enkele cellen in suspensie nodig zijn46,47. In dit protocol raden we clump passaging aan als de routinematige passaging-methode en bevelen we single-cell passaging alleen aan wanneer dit nodig is, bijvoorbeeld wanneer seeding van gedefinieerde celnummers vereist is, of tijdens sub-cloning.
Protocol
Representative Results
Discussion
iPSC’s zijn waardevolle celtypen omdat ze het mogelijk maken om anders ontoegankelijke celtypen in vitro te genereren. Omdat de uitgangsmaterialen voor herprogrammering, bijvoorbeeld fibroblasten, niet gemakkelijk beschikbaar zijn van alle primatensoorten, presenteert dit artikel een protocol voor het genereren van iPSC’s uit van urine afgeleide cellen. Deze cellen kunnen op een niet-invasieve manier worden verkregen, zelfs uit niet-steriele urinemonsters van primaten, door het kweekmedium aan te vullen met bree…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door DFG EN 1093/5-1 (projectnummer 458247426). M.O. werd ondersteund door JSPS Overseas Research Fellowship. Alle figuren zijn gemaakt met BioRender.com. Flowcytometrie werd uitgevoerd met behulp van de Core Facility Flow Cytometry in het Biomedical Center München. We willen Makoto Shida en Tomoyo Muto van ASHBi, Kyoto University, bedanken voor hun steun aan videografie.
Materials
| Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
| Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
| Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
| Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
| CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
| DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
| Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
| Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |
References
- Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
- Zoonomia Consortium, . A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
- Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nature Genetics. 46 (3), 310-315 (2014).
- Enard, W. Functional primate genomics-leveraging the medical potential. Journal of Molecular Medicine. 90 (5), 471-480 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Wunderlich, S., et al. Primate iPS cells as tools for evolutionary analyses. Stem Cell Research. 12 (3), 622-629 (2014).
- Denli, A. M., et al. Primate-specific ORF0 contributes to retrotransposon-mediated diversity. Cell. 163 (3), 583-593 (2015).
- Ramsay, L., et al. Conserved expression of transposon-derived non-coding transcripts in primate stem cells. BMC Genomics. 18 (1), 214 (2017).
- Marchetto, M. C. N., et al. Differential L1 regulation in pluripotent stem cells of humans and apes. Nature. 503 (7477), 525-529 (2013).
- Gallego Romero, ., I, , et al. A panel of induced pluripotent stem cells from chimpanzees: a resource for comparative functional genomics. eLife. 4, 07103 (2015).
- Pavlovic, B. J., Blake, L. E., Roux, J., Chavarria, C., Gilad, Y. A comparative assessment of human and chimpanzee iPSC-derived cardiomyocytes with primary heart tissues. Scientific Reports. 8 (1), 15312 (2018).
- Rhodes, K., et al. Human embryoid bodies as a novel system for genomic studies of functionally diverse cell types. eLife. 11, 71361 (2022).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Dannemann, M., Gallego Romero, ., I, Harnessing pluripotent stem cells as models to decipher human evolution. The FEBS Journal. 289 (11), 2992-3010 (2022).
- Geuder, J., et al. A non-invasive method to generate induced pluripotent stem cells from primate urine. Scientific Reports. 11 (1), 3516 (2021).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Aoi, T., et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 321 (5889), 699-702 (2008).
- Kim, J. B., et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature. 454 (7204), 646-650 (2008).
- Ruiz, S., et al. High-efficient generation of induced pluripotent stem cells from human astrocytes. PloS One. 5 (12), (2010).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Park, I. -. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. -. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
- Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Human Molecular Genetics. 18 (22), 4340-4349 (2009).
- Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15720-15725 (2009).
- Giorgetti, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using. OCT4 and SOX2. Cell Stem Cell. 5 (4), 353-357 (2009).
- Eminli, S., et al. Differentiation stage determines potential of hematopoietic cells for reprogramming into induced pluripotent stem cells. Nature Genetics. 41 (9), 968-976 (2009).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1221-1228 (2011).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Kaji, K., et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. 458 (7239), 771-775 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
- Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Ohnuki, M., et al. Dynamic regulation of human endogenous retroviruses mediates factor-induced reprogramming and differentiation potential. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (34), 12426-12431 (2014).
- Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genetics. 10 (6), 1004432 (2014).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 28 (8), 848-855 (2010).
- Koyanagi-Aoi, M., et al. Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (51), 20569-20574 (2013).
- Nishizawa, M., et al. Epigenetic variation between human induced pluripotent stem cell lines is an indicator of differentiation capacity. Cell Stem Cell. 19 (3), 341-354 (2016).
- Yokobayashi, S., et al. Inherent genomic properties underlie the epigenomic heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Cell Reports. 37 (5), 109909 (2021).
