Generación y mantenimiento de células madre pluripotentes inducidas por primates derivadas de la orina
Summary
El presente protocolo describe un método para aislar, expandir y reprogramar células derivadas de orina de primates humanos y no humanos a células madre pluripotentes inducidas (iPSC), así como instrucciones para el mantenimiento sin alimentador de las iPSC recién generadas.
Abstract
Los enfoques entre especies que estudian las células madre pluripotentes de los primates y sus derivados son cruciales para comprender mejor los mecanismos moleculares y celulares de la enfermedad, el desarrollo y la evolución. Para hacer que las células madre pluripotentes inducidas por primates (iPSC) sean más accesibles, este documento presenta un método no invasivo para generar iPSC de primates humanos y no humanos a partir de células derivadas de la orina, y su mantenimiento utilizando un método de cultivo sin alimentador.
La orina puede ser muestreada de un ambiente no estéril (por ejemplo, la jaula del animal) y tratada con un cóctel antibiótico de amplio espectro durante el cultivo celular primario para reducir la contaminación de manera eficiente. Después de la propagación de las células derivadas de la orina, las iPSC se generan mediante un método de transducción modificado de un sistema vectorial del virus Sendai disponible comercialmente. Las primeras colonias de iPSC ya pueden ser visibles después de 5 días, y se pueden recoger después de 10 días como muy pronto. El paso de grumos de rutina con tampón de disociación libre de enzimas apoya la pluripotencia de las iPSC generadas durante más de 50 pasajes.
Introduction
Las comparaciones genómicas de primates humanos y no humanos (NHP) son cruciales para comprender nuestra historia evolutiva y la evolución de los rasgos específicos de los humanos1. Además, estas comparaciones permiten inferir la función mediante la identificación de secuencias de ADN conservadas2, por ejemplo, para priorizar las variantes asociadas a la enfermedad3. Las comparaciones de fenotipos moleculares, como los niveles de expresión génica, son cruciales para interpretar mejor las comparaciones genómicas y descubrir, por ejemplo, las diferencias fenotípicas celulares. Además, tienen, similar a las comparaciones a nivel de ADN, el potencial de inferir relevancia funcional y, por lo tanto, de interpretar mejor la variación médicamente relevante dentro de los humanos4. La incorporación de datos fenotípicos moleculares completos en estos estudios comparativos requiere recursos biológicos apropiados (es decir, células ortólogas en todas las especies). Sin embargo, razones éticas y prácticas hacen que sea difícil o imposible acceder a tales células comparables, especialmente durante el desarrollo. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) permiten la generación de tales tipos de células inaccesibles in vitro5,6, son experimentalmente accesibles y se han utilizado para comparaciones de primates 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Para generar iPSCs, uno necesita adquirir las células primarias para ser reprogramadas. Las células aisladas de la orina tienen la ventaja de que pueden ser muestreadas de forma no invasiva de primates, y que pueden ser fácilmente reprogramadas, probablemente debido a sus perfiles moleculares similares a las células madre15. Las condiciones de cultivo para mantener las iPSCs de primates son tan importantes como la reprogramación; Clásicamente, el cultivo de células madre pluripotentes humanas requería un medio no definido, basado en suero y cocultivo de fibroblastos embrionarios de ratón – las llamadas células de alimentación – que proporcionan nutrientes esenciales y un andamio para las células madre embrionarias (ESC)16. Desde el desarrollo de sistemas de cultivo químicamente definidos y sin alimentadores17,18, ahora hay varias opciones de medios de cultivo y matrices iPSC disponibles comercialmente. Sin embargo, la mayoría de estas condiciones de cultivo se han optimizado para ESC e iPSC humanas y, por lo tanto, podrían funcionar menos bien en la cultura NHP iPSC. En este protocolo de video, proporcionamos instrucciones para generar y mantener iPSCs humanas y NHP derivadas del cultivo de células urinarias.
Desde el primer informe de generación de iPSC por la expresión forzada de factores definidos en fibroblastos en 2006, este método se ha aplicado a muchos tipos celulares diferentes de diversos orígenes 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Entre ellos, solo se pueden obtener células derivadas de la orina de una manera completamente no invasiva. Con base en el protocolo previamente descrito por Zhou et al.33, se pueden aislar y expandir células de orina de primates, incluso de muestras no estériles, complementando antibióticos de amplio espectro15. En particular, las células derivadas de orina muestreadas por este protocolo exhiben un alto potencial para producir iPSCs, en un período de tiempo más corto (las colonias se hacen visibles en 5-15 días) que la reprogramación convencional de fibroblastos (20-30 días, en nuestra experiencia), y con una tasa de éxito suficientemente alta. Estas células derivadas de la orina fueron clasificadas como la población mixta de células madre mesenquimales similares a células madre y células epiteliales de la vejiga, causando la alta eficiencia de reprogramación15.
Además de la variación en las celdas primarias, los métodos de reprogramación para generar iPSC también varían según el propósito del uso. Los procedimientos convencionales de reprogramación para células somáticas humanas se llevaron a cabo mediante la sobreexpresión de factores de reprogramación con vectores de retrovirus o lentivirus, lo que permitió la integración de ADN exógeno en el genoma 5,34,35. Para mantener las iPSC generadas genómicamente intactas, los investigadores han desarrollado una amplia variedad de sistemas de no integración: vector PiggyBac36,37 extirpable, vector episomal38,39, vectores de virus no integradores como el virus Sendai 40 y el adenovirus 41, transfección de ARNm42, transfección de proteínas 43,44 y tratamiento con compuestos químicos 45. Debido a la eficiencia y facilidad en el manejo, los vectores de reprogramación basados en virus Sendai se utilizan en este protocolo. La infección de las células primarias se realiza en un cultivo en suspensión de 1 h de células y virus a una multiplicidad de infección (MOI) de 5 antes del recubrimiento. Este paso modificado podría aumentar la probabilidad de contacto entre las superficies celulares y los virus, en comparación con el método convencional en el que los virus se agregan directamente al cultivo celular adherente, y así producir más colonias de iPSC15.
El paso de células madre pluripotentes humanas y NHP se puede hacer mediante el paso de grupos y el paso de células individuales. El ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) es un agente quelante rentable que se une a los iones de calcio y magnesio y, por lo tanto, impide la actividad adherente de la cadherina y la integrina. El EDTA también se utiliza como un reactivo de disociación selectiva suave, ya que las células indiferenciadas se desprenden antes que las células diferenciadas debido a sus diferentes moléculas de adhesión. La disociación completa induce la muerte celular masiva de las iPSC de primates a través de la hiperactivación de la miosina mediada por la bobina enrollada asociada a Rho/Rho (Rho/Rock). Por lo tanto, la suplementación del medio de cultivo con un inhibidor de Rho/Rock es esencial para experimentos que requieren células individuales en suspensión46,47. En este protocolo, recomendamos el paso por grupos como el método de paso de rutina y recomendamos el paso de una sola célula solo cuando sea necesario, por ejemplo, cuando se requiere la siembra de números de células definidos o durante la subclonación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las iPSC son tipos de células valiosas, ya que permiten la generación de tipos de células in vitro que de otro modo serían inaccesibles. Como los materiales de partida para la reprogramación, por ejemplo, los fibroblastos no están fácilmente disponibles de todas las especies de primates, este artículo presenta un protocolo para la generación de iPSCs a partir de células derivadas de la orina. Estas células se pueden obtener de manera no invasiva, incluso a partir de muestras de orina de primates no es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por DFG EN 1093/5-1 (proyecto número 458247426). M.O. fue apoyado por JSPS Overseas Research Fellowship. Todas las figuras fueron creadas con BioRender.com. La citometría de flujo se realizó con la ayuda de la citometría de flujo de la instalación central en el Centro Biomédico de Munich. Nos gustaría agradecer a Makoto Shida y Tomoyo Muto de ASHBi, Universidad de Kyoto, por el apoyo a la videografía.
Materials
| Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
| Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
| Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
| Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
| CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
| DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
| Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
| Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |
References
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