В настоящем протоколе описывается способ выделения, расширения и перепрограммирования клеток, полученных из мочи приматов человека и нечеловека, в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), а также инструкции по поддержанию вновь генерируемых ИПСК без фидера.
Межвидовые подходы к изучению плюрипотентных стволовых клеток приматов и их производных имеют решающее значение для лучшего понимания молекулярных и клеточных механизмов заболевания, развития и эволюции. Чтобы сделать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) приматов более доступными, в этой статье представлен неинвазивный метод получения ИПСК человека и нечеловека приматов из клеток, полученных из мочи, и их поддержание с использованием метода культивирования без фидера.
Моча может быть взята из нестерильной среды (например, клетки животного) и обработана коктейлем антибиотиков широкого спектра действия во время первичной клеточной культуры для эффективного снижения загрязнения. После размножения клеток, полученных из мочи, ИПСК генерируются модифицированным методом трансдукции коммерчески доступной системы векторного вируса Сендай. Первые колонии ИПСК могут быть видны уже через 5 дней и могут быть собраны не ранее чем через 10 дней. Рутинное пассирование комков с бесферментным диссоциационным буфером поддерживает плюрипотентность сгенерированных ИПСК в течение более чем 50 пассажей.
Геномные сравнения человека и нечеловекообразных приматов (NHP) имеют решающее значение для понимания нашей эволюционной истории и эволюции специфических для человека черт1. Кроме того, эти сравнения позволяют сделать вывод о функции путем идентификации консервативных последовательностейДНК 2, например, для определения приоритетности вариантов3, связанных с заболеванием. Сравнения молекулярных фенотипов, таких как уровни экспрессии генов, имеют решающее значение для лучшей интерпретации геномных сравнений и обнаружения, например, клеточных фенотипических различий. Кроме того, они, подобно сравнениям на уровне ДНК, обладают потенциалом для вывода о функциональной значимости и, следовательно, для лучшей интерпретации медицинских различий у людей4. Включение всеобъемлющих молекулярно-фенотипических данных в эти сравнительные исследования требует соответствующих биологических ресурсов (т.е. ортологичных клеток разных видов). Однако этические и практические причины затрудняют или делают невозможным доступ к таким сопоставимым клеткам, особенно во время развития. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) позволяют генерировать такие недоступные типы клеток in vitro5,6, доступны экспериментально и используются для сравнения приматов 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Чтобы генерировать ИПСК, необходимо приобрести первичные клетки, подлежащие перепрограммированию. Клетки, выделенные из мочи, имеют то преимущество, что они могут быть отобраны неинвазивным путем у приматов и что они могут быть легко перепрограммированы, вероятно, из-за их молекулярных профилей, подобных стволовым клеткам15. Условия культивирования для поддержания ИПСК приматов так же важны, как и перепрограммирование; Классически культура плюрипотентных стволовых клеток человека требовала неопределенной среды на основе сыворотки и совместной культуры эмбриональных фибробластов мыши – так называемых фидерных клеток, которые обеспечивают необходимые питательные вещества и каркас для эмбриональных стволовых клеток (ЭСК)16. С момента разработки химически определенных и не содержащих питательных культур17,18 в настоящее время существуют различные варианты коммерчески доступных питательных сред и матриц ИПСК. Тем не менее, большинство из этих условий культивирования были оптимизированы для ЭСК и ИПСК человека и, следовательно, могут работать хуже в культуре НПК ИПСК. В этом видеопротоколе мы предоставляем инструкции по созданию и поддержанию ИПСК человека и NHP, полученных из культуры мочевых клеток.
С момента первого сообщения о генерации ИПСК путем принудительной экспрессии определенных факторов в фибробластах в 2006 году этот метод применялся ко многим различным типам клеток различного происхождения 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Среди них только клетки, полученные из мочи, могут быть получены совершенно неинвазивным способом. Основываясь на ранее описанном протоколе Zhou et al.33, можно выделять и расширять клетки из мочи приматов даже из нестерильных образцов, добавляя антибиотики широкого спектра действия15. Примечательно, что клетки, полученные из мочи, отобранные по этому протоколу, демонстрируют высокий потенциал для продуцирования ИПСК в течение более короткого периода времени (колонии становятся видимыми через 5-15 дней), чем обычное перепрограммирование фибробластов (20-30 дней, по нашему опыту), и с достаточно высокой вероятностью успеха. Эти клетки, полученные из мочи, были классифицированы как смешанная популяция мезенхимальных стволовых клеток, подобных клеткам, и эпителиальных клеток мочевого пузыря, что обусловливало высокую эффективность перепрограммирования15.
В дополнение к различиям в первичных ячейках, методы перепрограммирования для генерации ИПСК также различаются в зависимости от цели использования. Обычные процедуры перепрограммирования для соматических клеток человека проводились путем сверхэкспрессии факторов перепрограммирования ретровирусными или лентивирусными векторами, что позволило интегрировать экзогенную ДНК в геном 5,34,35. Чтобы сохранить геномно сгенерированные ИПСК нетронутыми, исследователи разработали широкий спектр неинтегрирующихся систем – акцизный вектор PiggyBac 36,37, эписомальный вектор38,39, неинтегрирующиеся вирусные векторы, такие как вирус Сендай 40 и аденовирус 41, трансфекциямРНК 42, трансфекция белка 43,44 и обработка химическими соединениями 45. Из-за эффективности и простоты в обращении в этом протоколе используются векторы перепрограммирования на основе вирусов Sendai. Инфекцию первичных клеток проводят в суспензионной культуре клеток и вирусов за 1 ч при кратности инфекции (MOI) 5 до нанесения покрытия. Эта модифицированная стадия может увеличить вероятность контакта между клеточными поверхностями и вирусами по сравнению с традиционным методом, при котором вирусы добавляются непосредственно к адгезивной клеточной культуре и, таким образом, дают больше колоний iPSC15.
Пассаж плюрипотентных стволовых клеток человека и NHP может быть осуществлен путем пассажирования комков и пассажа отдельных клеток. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) является экономичным хелатирующим агентом, который связывает ионы кальция и магния и, таким образом, предотвращает адгезивную активность кадгерина и интегрина. ЭДТА также используется в качестве мягкого селективного реагента диссоциации, поскольку недифференцированные клетки отделяются раньше дифференцированных клеток из-за их различных молекул адгезии. Полная диссоциация индуцирует массивную гибель клеток ИПСК приматов через Rho/Rho-ассоциированную спиральную спираль, содержащую протеинкиназу (Rho/Rock)-опосредованную гиперактивацию миозина. Следовательно, добавление в питательную среду ингибитора Rho/Rock имеет важное значение для экспериментов, требующих одиночных клеток в суспензии46,47. В этом протоколе мы рекомендуем пассажирование сгустков в качестве рутинного метода пассажа и рекомендуем пассирование одной ячейки только тогда, когда это необходимо, например, когда требуется заполнение определенных номеров ячеек или во время субклонирования.
ИПСК являются ценными типами клеток, поскольку они позволяют генерировать иначе недоступные типы клеток in vitro. В качестве исходных материалов для перепрограммирования, например, фибробласты не всегда доступны для всех видов приматов, в этой статье представлен протокол генерации ?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана DFG EN 1093/5-1 (номер проекта 458247426). М.О. был поддержан JSPS Overseas Research Fellowship. Все фигурки были созданы с BioRender.com. Проточная цитометрия проводилась с помощью проточной цитометрии Core Facility в Биомедицинском центре Мюнхена. Мы хотели бы поблагодарить Макото Шиду и Томоё Муто из ASHBi, Киотский университет, за поддержку видеосъемки.
Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |