JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Генерация и поддержание индуцированных приматами плюрипотентных стволовых клеток, полученных из мочи

Published: July 28, 2023
doi:
10.3791/64922
, , , ,
1Faculty of Biology,Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for the Advanced Study of Human Biology,Kyoto University, 3Hakubi Center,Kyoto University

Summary

В настоящем протоколе описывается способ выделения, расширения и перепрограммирования клеток, полученных из мочи приматов человека и нечеловека, в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), а также инструкции по поддержанию вновь генерируемых ИПСК без фидера.

Abstract

Межвидовые подходы к изучению плюрипотентных стволовых клеток приматов и их производных имеют решающее значение для лучшего понимания молекулярных и клеточных механизмов заболевания, развития и эволюции. Чтобы сделать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) приматов более доступными, в этой статье представлен неинвазивный метод получения ИПСК человека и нечеловека приматов из клеток, полученных из мочи, и их поддержание с использованием метода культивирования без фидера.

Моча может быть взята из нестерильной среды (например, клетки животного) и обработана коктейлем антибиотиков широкого спектра действия во время первичной клеточной культуры для эффективного снижения загрязнения. После размножения клеток, полученных из мочи, ИПСК генерируются модифицированным методом трансдукции коммерчески доступной системы векторного вируса Сендай. Первые колонии ИПСК могут быть видны уже через 5 дней и могут быть собраны не ранее чем через 10 дней. Рутинное пассирование комков с бесферментным диссоциационным буфером поддерживает плюрипотентность сгенерированных ИПСК в течение более чем 50 пассажей.

Introduction

Геномные сравнения человека и нечеловекообразных приматов (NHP) имеют решающее значение для понимания нашей эволюционной истории и эволюции специфических для человека черт1. Кроме того, эти сравнения позволяют сделать вывод о функции путем идентификации консервативных последовательностейДНК 2, например, для определения приоритетности вариантов3, связанных с заболеванием. Сравнения молекулярных фенотипов, таких как уровни экспрессии генов, имеют решающее значение для лучшей интерпретации геномных сравнений и обнаружения, например, клеточных фенотипических различий. Кроме того, они, подобно сравнениям на уровне ДНК, обладают потенциалом для вывода о функциональной значимости и, следовательно, для лучшей интерпретации медицинских различий у людей4. Включение всеобъемлющих молекулярно-фенотипических данных в эти сравнительные исследования требует соответствующих биологических ресурсов (т.е. ортологичных клеток разных видов). Однако этические и практические причины затрудняют или делают невозможным доступ к таким сопоставимым клеткам, особенно во время развития. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) позволяют генерировать такие недоступные типы клеток in vitro5,6, доступны экспериментально и используются для сравнения приматов 6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Чтобы генерировать ИПСК, необходимо приобрести первичные клетки, подлежащие перепрограммированию. Клетки, выделенные из мочи, имеют то преимущество, что они могут быть отобраны неинвазивным путем у приматов и что они могут быть легко перепрограммированы, вероятно, из-за их молекулярных профилей, подобных стволовым клеткам15. Условия культивирования для поддержания ИПСК приматов так же важны, как и перепрограммирование; Классически культура плюрипотентных стволовых клеток человека требовала неопределенной среды на основе сыворотки и совместной культуры эмбриональных фибробластов мыши – так называемых фидерных клеток, которые обеспечивают необходимые питательные вещества и каркас для эмбриональных стволовых клеток (ЭСК)16. С момента разработки химически определенных и не содержащих питательных культур17,18 в настоящее время существуют различные варианты коммерчески доступных питательных сред и матриц ИПСК. Тем не менее, большинство из этих условий культивирования были оптимизированы для ЭСК и ИПСК человека и, следовательно, могут работать хуже в культуре НПК ИПСК. В этом видеопротоколе мы предоставляем инструкции по созданию и поддержанию ИПСК человека и NHP, полученных из культуры мочевых клеток.

С момента первого сообщения о генерации ИПСК путем принудительной экспрессии определенных факторов в фибробластах в 2006 году этот метод применялся ко многим различным типам клеток различного происхождения 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Среди них только клетки, полученные из мочи, могут быть получены совершенно неинвазивным способом. Основываясь на ранее описанном протоколе Zhou et al.33, можно выделять и расширять клетки из мочи приматов даже из нестерильных образцов, добавляя антибиотики широкого спектра действия15. Примечательно, что клетки, полученные из мочи, отобранные по этому протоколу, демонстрируют высокий потенциал для продуцирования ИПСК в течение более короткого периода времени (колонии становятся видимыми через 5-15 дней), чем обычное перепрограммирование фибробластов (20-30 дней, по нашему опыту), и с достаточно высокой вероятностью успеха. Эти клетки, полученные из мочи, были классифицированы как смешанная популяция мезенхимальных стволовых клеток, подобных клеткам, и эпителиальных клеток мочевого пузыря, что обусловливало высокую эффективность перепрограммирования15.

В дополнение к различиям в первичных ячейках, методы перепрограммирования для генерации ИПСК также различаются в зависимости от цели использования. Обычные процедуры перепрограммирования для соматических клеток человека проводились путем сверхэкспрессии факторов перепрограммирования ретровирусными или лентивирусными векторами, что позволило интегрировать экзогенную ДНК в геном 5,34,35. Чтобы сохранить геномно сгенерированные ИПСК нетронутыми, исследователи разработали широкий спектр неинтегрирующихся систем – акцизный вектор PiggyBac 36,37, эписомальный вектор38,39, неинтегрирующиеся вирусные векторы, такие как вирус Сендай 40 и аденовирус 41, трансфекциямРНК 42, трансфекция белка 43,44 и обработка химическими соединениями 45. Из-за эффективности и простоты в обращении в этом протоколе используются векторы перепрограммирования на основе вирусов Sendai. Инфекцию первичных клеток проводят в суспензионной культуре клеток и вирусов за 1 ч при кратности инфекции (MOI) 5 до нанесения покрытия. Эта модифицированная стадия может увеличить вероятность контакта между клеточными поверхностями и вирусами по сравнению с традиционным методом, при котором вирусы добавляются непосредственно к адгезивной клеточной культуре и, таким образом, дают больше колоний iPSC15.

Пассаж плюрипотентных стволовых клеток человека и NHP может быть осуществлен путем пассажирования комков и пассажа отдельных клеток. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) является экономичным хелатирующим агентом, который связывает ионы кальция и магния и, таким образом, предотвращает адгезивную активность кадгерина и интегрина. ЭДТА также используется в качестве мягкого селективного реагента диссоциации, поскольку недифференцированные клетки отделяются раньше дифференцированных клеток из-за их различных молекул адгезии. Полная диссоциация индуцирует массивную гибель клеток ИПСК приматов через Rho/Rho-ассоциированную спиральную спираль, содержащую протеинкиназу (Rho/Rock)-опосредованную гиперактивацию миозина. Следовательно, добавление в питательную среду ингибитора Rho/Rock имеет важное значение для экспериментов, требующих одиночных клеток в суспензии46,47. В этом протоколе мы рекомендуем пассажирование сгустков в качестве рутинного метода пассажа и рекомендуем пассирование одной ячейки только тогда, когда это необходимо, например, когда требуется заполнение определенных номеров ячеек или во время субклонирования.

Protocol

Эта экспериментальная процедура была одобрена ответственным этическим комитетом по экспериментам на людях (20-122, Ethikkommission LMU München). Все эксперименты проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами.ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом экспериментов, связанных …

Representative Results

При выделении клеток из мочи человека и NHP различные типы клеток могут быть идентифицированы непосредственно после выделения. Плоскоклеточные клетки, а также различные более мелкие круглые клетки выводятся с мочой; женская моча содержит гораздо больше плоскоклеточных клеток, чем мужс…

Discussion

ИПСК являются ценными типами клеток, поскольку они позволяют генерировать иначе недоступные типы клеток in vitro. В качестве исходных материалов для перепрограммирования, например, фибробласты не всегда доступны для всех видов приматов, в этой статье представлен протокол генерации ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана DFG EN 1093/5-1 (номер проекта 458247426). М.О. был поддержан JSPS Overseas Research Fellowship. Все фигурки были созданы с BioRender.com. Проточная цитометрия проводилась с помощью проточной цитометрии Core Facility в Биомедицинском центре Мюнхена. Мы хотели бы поблагодарить Макото Шиду и Томоё Муто из ASHBi, Киотский университет, за поддержку видеосъемки.

Materials

Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) Sigma-Aldrich SCR006
Amphotericin B-Solution Merck A2941-100ML
Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody  Stem Cell Technologies 60064 Dilution: 1/200
Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody  Miltenyi Biotec 130-122-965 Dilution: 1/50
Bambanker™ (Cell freezing medium) Nippon Genetics BB01
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A3059-100G
Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR Greiner BIO-ONE 665180
Countess™ II automated cell counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) Sued-Laborbedarf 52 95-0213 Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information.
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) Thermo Fisher Scientific A16519
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) Thermo Fisher Scientific A16518
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride Sigma-Aldrich 10236276001
DMEM High Glucose TH.Geyer L0102
DMEM/F12 w L-glutamine Fisher Scientific 15373541
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 Thermo Fisher Scientific A-21202 Dilution: 1/500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 Thermo Fisher Scientific A-21207 Dilution: 1/500
DPBS w/o Calcium w/o Magnesium TH.Geyer L0615-500
EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) Thermo Fisher Scientific 710524 Dilution: 1/500
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Carl Roth CN06.3
Falcon Tube 15 mL conical bottom Greiner BIO-ONE 188271-N
Falcon Tube 50 mL conical bottom Greiner BIO-ONE 227261
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) Thermo Fisher Scientific 10500064
FlowJo V10.8.2 FlowJo  663441
Gelatin from porcine skin Sigma-Aldrich G1890-1KG
Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413301
GlutaMAX™ Supplement Thermo Fisher Scientific 35050038
Heracell™ 240i CO2 incubator Fisher Scientific 16416639
Heraeus HeraSafe safety cabinet Kendro 51017905
Human EGF, premium grade Miltenyi Biotec 130-097-749
ImageJ  Fiji Version 2.9.0
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140035
Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL Nerbe Plus 04-212-1000
Microscope Nikon eclipse TE2000-S Nikon TE2000-S
Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody R&D Systems MAB1368 Dilution: 1/100
Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody R&D Systems MAB1420 Dilution: 1/100
Mouse anti-beta-III Tubulin antibody R&D Systems MAB1195 Dilution: 1/100
mTeSR™ 1 STEMCELL Technolgies 85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb  Cell Signaling Technology 4903S Dilution: 1/400
Normocure™ (Antimicrobial Reagent) Invivogen ant-noc
Oct-4 Rabbit Antibody  Cell Signaling Technology 2750S Dilution: 1/400
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich 441244-1KG
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) Thermo Fisher Scientific 15140122 Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin.
Recombinant Human FGF-basic PeproTech 100-18B
Recombinant Human PDGF-AB PeproTech 100-00AB
Refrigerated benchtop centrifuge SIGMA  4-16KS
Renal Epithelial Cell Basal Medium ATCC PCS-400-030
Renal Epithelial Cell Growth Kit ATCC PCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 Cell Signaling Technology 4900S Dilution: 1/400
SSEA4 (MC813) Mouse mAb NEB 4755S Dilution: 1/500
StemFit® Basic02 Nippon Genetics 3821.00 The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead.
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787-50ML
TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) Thermo Fisher Scientific 12563011
Waterbath Precision GP 05 Thermo Fisher Scientific TSGP05
Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) Biozol BYT-ORB153635
Antibody dilution buffer For composition see the supplementary table S1
Blocking buffer For composition see the supplementary table S1
REMC medium For composition see the supplementary table S1
Primary urine medium For composition see the supplementary table S1
PSC culture medium For composition see the supplementary table S1
PSC generation medium For composition see the supplementary table S1
Urine wash buffer For composition see the supplementary table S1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
  2. Zoonomia Consortium, . A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
  3. Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nature Genetics. 46 (3), 310-315 (2014).
  4. Enard, W. Functional primate genomics-leveraging the medical potential. Journal of Molecular Medicine. 90 (5), 471-480 (2012).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Wunderlich, S., et al. Primate iPS cells as tools for evolutionary analyses. Stem Cell Research. 12 (3), 622-629 (2014).
  7. Denli, A. M., et al. Primate-specific ORF0 contributes to retrotransposon-mediated diversity. Cell. 163 (3), 583-593 (2015).
  8. Ramsay, L., et al. Conserved expression of transposon-derived non-coding transcripts in primate stem cells. BMC Genomics. 18 (1), 214 (2017).
  9. Marchetto, M. C. N., et al. Differential L1 regulation in pluripotent stem cells of humans and apes. Nature. 503 (7477), 525-529 (2013).
  10. Gallego Romero, ., I, , et al. A panel of induced pluripotent stem cells from chimpanzees: a resource for comparative functional genomics. eLife. 4, 07103 (2015).
  11. Pavlovic, B. J., Blake, L. E., Roux, J., Chavarria, C., Gilad, Y. A comparative assessment of human and chimpanzee iPSC-derived cardiomyocytes with primary heart tissues. Scientific Reports. 8 (1), 15312 (2018).
  12. Rhodes, K., et al. Human embryoid bodies as a novel system for genomic studies of functionally diverse cell types. eLife. 11, 71361 (2022).
  13. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  14. Dannemann, M., Gallego Romero, ., I, Harnessing pluripotent stem cells as models to decipher human evolution. The FEBS Journal. 289 (11), 2992-3010 (2022).
  15. Geuder, J., et al. A non-invasive method to generate induced pluripotent stem cells from primate urine. Scientific Reports. 11 (1), 3516 (2021).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  17. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  18. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  19. Aoi, T., et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 321 (5889), 699-702 (2008).
  20. Kim, J. B., et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature. 454 (7204), 646-650 (2008).
  21. Ruiz, S., et al. High-efficient generation of induced pluripotent stem cells from human astrocytes. PloS One. 5 (12), (2010).
  22. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  23. Park, I. -. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  24. Loh, Y. -. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
  25. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Human Molecular Genetics. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  26. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15720-15725 (2009).
  27. Giorgetti, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using. OCT4 and SOX2. Cell Stem Cell. 5 (4), 353-357 (2009).
  28. Eminli, S., et al. Differentiation stage determines potential of hematopoietic cells for reprogramming into induced pluripotent stem cells. Nature Genetics. 41 (9), 968-976 (2009).
  29. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  30. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  31. Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1221-1228 (2011).
  32. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  33. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080-2089 (2012).
  34. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  35. Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).
  36. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  37. Kaji, K., et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. 458 (7239), 771-775 (2009).
  38. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  39. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  40. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
  41. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  42. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  43. Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
  44. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
  45. Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
  46. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  47. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  48. Ohnuki, M., et al. Dynamic regulation of human endogenous retroviruses mediates factor-induced reprogramming and differentiation potential. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (34), 12426-12431 (2014).
  49. Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genetics. 10 (6), 1004432 (2014).
  50. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  51. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 28 (8), 848-855 (2010).
  52. Koyanagi-Aoi, M., et al. Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (51), 20569-20574 (2013).
  53. Nishizawa, M., et al. Epigenetic variation between human induced pluripotent stem cell lines is an indicator of differentiation capacity. Cell Stem Cell. 19 (3), 341-354 (2016).
  54. Yokobayashi, S., et al. Inherent genomic properties underlie the epigenomic heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Cell Reports. 37 (5), 109909 (2021).

Tags

PrimateInduced Pluripotent Stem CellsUrinary CellsNon-invasiveSendai VirusReprogrammingBasement Membrane MatrixREMC MediumCentrifugationCell Culture
check_url/64922?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Radmer, J., Geuder, J., Edenhofer, F. C., Enard, W., Ohnuki, M. Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine. J. Vis. Exp. (197), e64922, doi:10.3791/64922 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image