Generering och underhåll av primatinducerade pluripotenta stamceller härrörande från urin
Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att isolera, expandera och omprogrammera humana och icke-mänskliga urinceller från primater till inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs), samt instruktioner för matarfritt underhåll av de nyligen genererade iPSC.
Abstract
Artöverskridande tillvägagångssätt som studerar primatpluripotenta stamceller och deras derivat är avgörande för att bättre förstå de molekylära och cellulära mekanismerna för sjukdom, utveckling och evolution. För att göra primatinducerade pluripotenta stamceller (iPSC) mer tillgängliga presenterar denna artikel en icke-invasiv metod för att generera humana och icke-mänskliga primat-iPSC från urinhärledda celler och deras underhåll med hjälp av en matarfri odlingsmetod.
Urinen kan provtas från en icke-steril miljö (t.ex. djurets bur) och behandlas med en bredspektrum antibiotikacocktail under primär cellodling för att effektivt minska kontaminering. Efter förökning av de urinhärledda cellerna genereras iPSC genom en modifierad transduktionsmetod av ett kommersiellt tillgängligt Sendai-virusvektorsystem. De första iPSC-kolonierna kan vara synliga efter 5 dagar och kan plockas tidigast efter 10 dagar. Rutinmässig klumppassaging med enzymfri dissociationsbuffert stöder pluripotens hos de genererade iPSC: erna i mer än 50 passager.
Introduction
Genomiska jämförelser av mänskliga och icke-mänskliga primater (NHP) är avgörande för att förstå vår evolutionära historia och utvecklingen av människospecifika egenskaper1. Dessutom möjliggör dessa jämförelser inferens av funktion genom att identifiera bevarade DNA-sekvenser2, t.ex. för att prioritera sjukdomsassocierade varianter3. Jämförelser av molekylära fenotyper såsom genuttrycksnivåer är avgörande för att bättre tolka genomiska jämförelser och för att upptäcka till exempel cellulära fenotypiska skillnader. Dessutom har de – i likhet med jämförelser på DNA-nivå – potential att härleda funktionell relevans och därmed bättre tolka medicinskt relevant variation inom människor4. Införlivandet av omfattande molekylära fenotypiska data i dessa jämförande studier kräver lämpliga biologiska resurser (dvs. ortologa celler över arter). Etiska och praktiska skäl gör det dock svårt eller omöjligt att få tillgång till sådana jämförbara celler, särskilt under utvecklingen. Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) möjliggör generering av sådana otillgängliga celltyper in vitro5,6, är experimentellt tillgängliga och har använts för primatjämförelser 6,7,8,9,10,11,12,13,14.
För att generera iPSC måste man förvärva de primära cellerna som ska omprogrammeras. Celler isolerade från urin har fördelen att de kan provtas icke-invasivt från primater och att de lätt kan omprogrammeras, troligen på grund av deras stamcellsliknande molekylära profiler15. Odlingsförhållandena för att upprätthålla primat-iPSC är lika viktiga som omprogrammering; Klassiskt krävde odling av humana pluripotenta stamceller ett odefinierat, serumbaserat medium och samodling av musembryonala fibroblaster – så kallade matarceller – som tillhandahåller viktiga näringsämnen och en byggnadsställning för embryonala stamceller (ESC)16. Sedan utvecklingen av kemiskt definierade och matarfria odlingssystem17,18 finns det nu olika alternativ för kommersiellt tillgängliga iPSC-odlingsmedier och matriser. De flesta av dessa odlingsförhållanden har dock optimerats för humana ESC och iPSC, och kan därför fungera mindre bra i NHP iPSC-kulturen. I detta videoprotokoll tillhandahåller vi instruktioner för att generera och underhålla humana och NHP iPSC härledda från urincellsodling.
Sedan den första rapporten om iPSC-generering genom tvångsuttryck av definierade faktorer i fibroblaster 2006 har denna metod tillämpats på många olika celltyper av olika ursprung 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Bland dem kan endast urin-härledda celler erhållas på ett helt icke-invasivt sätt. Baserat på det tidigare beskrivna protokollet av Zhou et al.33 kan man isolera och expandera celler från primaturin även från icke-sterila prover, genom att komplettera bredspektrumantibiotika15. I synnerhet uppvisar urin-härledda celler som provtas av detta protokoll en hög potential att producera iPSCs, inom en kortare tidsperiod (kolonier blir synliga inom 5-15 dagar) än den konventionella omprogrammeringen av fibroblaster (20-30 dagar, enligt vår erfarenhet), och med en tillräckligt hög framgångsgrad. Dessa urin-härledda celler klassificerades som den blandade populationen av mesenkymala stamcellsliknande celler och blåsepitelceller, vilket orsakade den höga omprogrammeringseffektiviteten15.
Förutom variationen i primära celler varierar omprogrammeringsmetoderna för att generera iPSC också beroende på användningsändamålet. Konventionella omprogrammeringsprocedurer för humana somatiska celler utfördes genom överuttryck av omprogrammeringsfaktorer med retrovirus- eller lentivirusvektorer, vilket möjliggjorde integrationen av exogent DNA i genomet 5,34,35. För att hålla de genererade iPSC: erna genomiskt intakta har forskare utvecklat ett brett utbud av icke-integrationssystem – punktskattepliktig PiggyBac-vektor 36,37, episomal vektor38,39, icke-integrerande virusvektorer såsom Sendai-virus 40 och adenovirus 41, mRNA-transfektion 42, proteintransfektion 43,44 och kemisk föreningsbehandling 45. På grund av effektiviteten och enkel hantering används Sendai-virusbaserade omprogrammeringsvektorer i detta protokoll. Infektion av primära celler utförs i en 1 h suspensionskultur av celler och virus vid en multiplicitet av infektion (MOI) av 5 före plätering. Detta modifierade steg kan öka sannolikheten för kontakt mellan cellytor och virus, jämfört med den konventionella metoden där virusen tillsätts direkt till den vidhäftande cellkulturen, och därmed ge fler iPSC-kolonier15.
Passaging av humana och NHP pluripotenta stamceller kan göras genom klumppassaging och single-cell passaging. Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) är ett kostnadseffektivt kelatbildare som binder kalcium- och magnesiumjoner och därmed förhindrar vidhäftande aktivitet av kadherin och integrin. EDTA används också som ett mildt, selektivt dissociationsreagens, eftersom odifferentierade celler lossnar före differentierade celler på grund av deras olika vidhäftningsmolekyler. Fullständig dissociation inducerar massiv celldöd hos primat-iPSC via Rho/Rho-associerad spole innehållande proteinkinas (Rho/Rock)-medierad myosinhyperaktivering. Därför är det viktigt att komplettera odlingsmediet med en Rho / Rock-hämmare för experiment som kräver enstaka celler i suspension46,47. I detta protokoll rekommenderar vi klumppassaging som rutinpasseringsmetod och rekommenderar encellspassaging endast när det är nödvändigt, t.ex. när seeding av definierade cellnummer krävs, eller under subkloning.
Protocol
Representative Results
Discussion
iPSC är värdefulla celltyper eftersom de möjliggör generering av annars otillgängliga celltyper in vitro. Eftersom utgångsmaterialen för omprogrammering, till exempel, fibroblaster inte är lätt tillgängliga från alla primatarter, presenterar detta dokument ett protokoll för generering av iPSC från urin-härledda celler. Dessa celler kan erhållas på ett icke-invasivt sätt, även från icke-sterila primaturinprover, genom att komplettera odlingsmediet med bredspektrum antibiotika.
<p class="jov…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av DFG EN 1093/5-1 (projektnummer 458247426). M.O. stöddes av JSPS Overseas Research Fellowship. Alla siffror skapades med BioRender.com. Flödescytometri utfördes med hjälp av Core Facility Flow Cytometry vid Biomedical Center München. Vi vill tacka Makoto Shida och Tomoyo Muto från ASHBi, Kyoto University, för stöd till videografi.
Materials
| Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Amphotericin B-Solution | Merck | A2941-100ML | |
| Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody | Stem Cell Technologies | 60064 | Dilution: 1/200 |
| Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Dilution: 1/50 |
| Bambanker™ (Cell freezing medium) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information. |
| CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM High Glucose | TH.Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-glutamine | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Dilution: 1/500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Dilution: 1/500 |
| DPBS w/o Calcium w/o Magnesium | TH.Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Dilution: 1/500 |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL conical bottom | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | 663441 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i CO2 incubator | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe safety cabinet | Kendro | 51017905 | |
| Human EGF, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Version 2.9.0 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Microcentrifugation tube PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Microscope Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibody | R&D Systems | MAB1368 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibody | R&D Systems | MAB1420 | Dilution: 1/100 |
| Mouse anti-beta-III Tubulin antibody | R&D Systems | MAB1195 | Dilution: 1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 4903S | Dilution: 1/400 |
| Normocure™ (Antimicrobial Reagent) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Rabbit Antibody | Cell Signaling Technology | 2750S | Dilution: 1/400 |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin. |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SIGMA | 4-16KS | |
| Renal Epithelial Cell Basal Medium | ATCC | PCS-400-030 | |
| Renal Epithelial Cell Growth Kit | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900 | Cell Signaling Technology | 4900S | Dilution: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) Mouse mAb | NEB | 4755S | Dilution: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Antibody dilution buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Blocking buffer | For composition see the supplementary table S1 | ||
| REMC medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Primary urine medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC culture medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| PSC generation medium | For composition see the supplementary table S1 | ||
| Urine wash buffer | For composition see the supplementary table S1 |
References
- Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
- Zoonomia Consortium, . A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
- Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nature Genetics. 46 (3), 310-315 (2014).
- Enard, W. Functional primate genomics-leveraging the medical potential. Journal of Molecular Medicine. 90 (5), 471-480 (2012).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Wunderlich, S., et al. Primate iPS cells as tools for evolutionary analyses. Stem Cell Research. 12 (3), 622-629 (2014).
- Denli, A. M., et al. Primate-specific ORF0 contributes to retrotransposon-mediated diversity. Cell. 163 (3), 583-593 (2015).
- Ramsay, L., et al. Conserved expression of transposon-derived non-coding transcripts in primate stem cells. BMC Genomics. 18 (1), 214 (2017).
- Marchetto, M. C. N., et al. Differential L1 regulation in pluripotent stem cells of humans and apes. Nature. 503 (7477), 525-529 (2013).
- Gallego Romero, ., I, , et al. A panel of induced pluripotent stem cells from chimpanzees: a resource for comparative functional genomics. eLife. 4, 07103 (2015).
- Pavlovic, B. J., Blake, L. E., Roux, J., Chavarria, C., Gilad, Y. A comparative assessment of human and chimpanzee iPSC-derived cardiomyocytes with primary heart tissues. Scientific Reports. 8 (1), 15312 (2018).
- Rhodes, K., et al. Human embryoid bodies as a novel system for genomic studies of functionally diverse cell types. eLife. 11, 71361 (2022).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Dannemann, M., Gallego Romero, ., I, Harnessing pluripotent stem cells as models to decipher human evolution. The FEBS Journal. 289 (11), 2992-3010 (2022).
- Geuder, J., et al. A non-invasive method to generate induced pluripotent stem cells from primate urine. Scientific Reports. 11 (1), 3516 (2021).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Aoi, T., et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 321 (5889), 699-702 (2008).
- Kim, J. B., et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature. 454 (7204), 646-650 (2008).
- Ruiz, S., et al. High-efficient generation of induced pluripotent stem cells from human astrocytes. PloS One. 5 (12), (2010).
- Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
- Park, I. -. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. -. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
- Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Human Molecular Genetics. 18 (22), 4340-4349 (2009).
- Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15720-15725 (2009).
- Giorgetti, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using. OCT4 and SOX2. Cell Stem Cell. 5 (4), 353-357 (2009).
- Eminli, S., et al. Differentiation stage determines potential of hematopoietic cells for reprogramming into induced pluripotent stem cells. Nature Genetics. 41 (9), 968-976 (2009).
- Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1221-1228 (2011).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080-2089 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
- Kaji, K., et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. 458 (7239), 771-775 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
- Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
- Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
- Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Ohnuki, M., et al. Dynamic regulation of human endogenous retroviruses mediates factor-induced reprogramming and differentiation potential. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (34), 12426-12431 (2014).
- Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genetics. 10 (6), 1004432 (2014).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 28 (8), 848-855 (2010).
- Koyanagi-Aoi, M., et al. Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (51), 20569-20574 (2013).
- Nishizawa, M., et al. Epigenetic variation between human induced pluripotent stem cell lines is an indicator of differentiation capacity. Cell Stem Cell. 19 (3), 341-354 (2016).
- Yokobayashi, S., et al. Inherent genomic properties underlie the epigenomic heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Cell Reports. 37 (5), 109909 (2021).
