Subcellulær billeddannelse af neuronal calciumhåndtering in vivo

Summary

De nuværende metoder beskriver en ikke-ratiometrisk tilgang til calciumbilleddannelse i høj opløsning i subcompartment in vivo i Caenorhabditis elegans ved hjælp af let tilgængelige genetisk kodede calciumindikatorer.

Abstract

Calcium (Ca 2+) billeddannelse er i vid udstrækning blevet brugt til at undersøge neuronal aktivitet, men det bliver stadig mere klart, at subcellulær Ca²⁺ håndtering er en afgørende komponent i intracellulær signalering. Visualiseringen af subcellulær Ca²⁺ dynamik in vivo, hvor neuroner kan studeres i deres oprindelige, intakte kredsløb, har vist sig teknisk udfordrende i komplekse nervesystemer. Gennemsigtigheden og det relativt enkle nervesystem hos nematoden Caenorhabditis elegans muliggør cellespecifik ekspression og in vivo-visualisering af fluorescerende tags og indikatorer. Blandt disse er fluorescerende indikatorer, der er blevet modificeret til brug i cytoplasmaet, såvel som forskellige subcellulære rum, såsom mitokondrier. Denne protokol muliggør ikke-ratiometrisk Ca 2+ billeddannelse in vivo med en subcellulær opløsning, der tillader analyse af Ca²⁺ dynamik ned til niveauet for individuelle dendritiske rygsøjler og mitokondrier. Her bruges to tilgængelige genetisk kodede indikatorer med forskellige Ca 2+ affiniteter til at demonstrere brugen af denne protokol til måling af relative Ca²⁺ niveauer inden for cytoplasma eller mitokondriematrix i et enkelt par excitatoriske interneuroner (AVA). Sammen med de genetiske manipulationer og langsgående observationer, der er mulige i C. elegans, kan denne billeddannelsesprotokol være nyttig til at besvare spørgsmål om, hvordan Ca²⁺ håndtering regulerer neuronal funktion og plasticitet.

Introduction

Calciumioner (Ca²⁺) er meget alsidige bærere af information i mange celletyper. I neuroner er Ca²⁺ ansvarlig for den aktivitetsafhængige frigivelse af neurotransmittere, reguleringen af cytoskeletal motilitet, finjustering af metaboliske processer samt mange andre mekanismer, der kræves for korrekt neuronal vedligeholdelse og funktion ^1,2. For at sikre effektiv intracellulær signalering skal neuroner opretholde lave basale Ca²⁺ niveauer i deres cytoplasma³. Dette opnås ved hjælp af kooperative Ca 2+ håndteringsmekanismer, herunder optagelse af Ca²⁺ i organeller såsom endoplasmatisk retikulum (ER) og mitokondrier. Disse processer, ud over arrangementet af Ca 2+-permeable ionkanaler i plasmamembranen, resulterer i heterogene niveauer af cytoplasmatisk Ca²⁺ i hele neuronen.

Ca 2+ heterogenitet under hvile og neuronal aktivering giver mulighed for forskelligartet, placeringsspecifik regulering af Ca ²⁺-afhængige mekanismer 1. Et eksempel på de koncentrationsspecifikke virkninger af Ca 2+ er frigivelsen af Ca ²⁺ fra ER gennem inositol 1,4,5-trisphosphat (InsP 3) receptorer. Lave Ca²⁺ niveauer i kombination med InsP₃ er nødvendige for åbningen af receptorens calciumgennemtrængelige pore. Alternativt hæmmer høje Ca²⁺ niveauer både direkte og indirekte receptoren⁴. Betydningen af Ca 2+ homeostase for korrekt neuronal funktion understøttes af beviser, der tyder på, at forstyrret intracellulær Ca²⁺ håndtering og signalering er et tidligt skridt i patogenesen af neurodegenerative lidelser og naturlig aldring ^5,6. Specifikt er unormal Ca²⁺ optagelse og frigivelse af ER og mitokondrier forbundet med begyndelsen af neuronal dysfunktion ved Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom og Huntingtons sygdom ^6,7.

Undersøgelsen af Ca 2+ dyshomeostase under naturlig aldring eller neurodegeneration kræver langsgående observation af Ca²⁺ niveauer med subcellulær opløsning i en levende, intakt organisme, hvor den oprindelige cellulære arkitektur (dvs. arrangementet af synapser og fordeling af ionkanaler) opretholdes. Til dette formål giver denne protokol vejledning om brugen af to let tilgængelige, genetisk kodede Ca 2+ sensorer til registrering af Ca²⁺ dynamik in vivo med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. De repræsentative resultater opnået ved hjælp af den beskrevne metode i C. elegans demonstrerer, hvordan ekspressionen af Ca 2+ indikatorer i cytoplasma eller mitokondriematrix af enkelte neuroner kan muliggøre hurtig erhvervelse af fluorescerende billeder (op til 50 Hz), der illustrerer Ca 2+ dynamikken med den ekstra evne til at skelne Ca ²⁺ niveauerne inden for enkelt rygsøjlelignende strukturer og individuelle mitokondrier.

Protocol

1. Oprettelse af transgene stammer Ved hjælp af en kloningsmetode efter eget valg8,9, klonekspressionsvektorer til at indeholde Pflp-18- eller Prig-3-promotoren (for AVA-specifikt signal i ventralnervestrengen) efterfulgt af den valgte Ca2+-indikator og derefter en 3′ UTR (se diskussionen for mere information)10. En liste over plasmider og deres kilder findes i supplerende ta…

Representative Results

Disse to protokoller muliggør hurtig erhvervelse af differentielle Ca2+ niveauer inden for de subcellulære regioner og organeller af individuelle neuritter in vivo med høj rumlig opløsning. Den første protokol muliggør måling af cytoplasmatisk Ca2+ med høj tidsmæssig og rumlig opløsning. Dette demonstreres her ved hjælp af det cellespecifikke udtryk for GCaMP6f i den glutamaterge AVA-kommando interneuroner15, hvis neuritter løber hele længden af den vent…

Discussion

Den første overvejelse ved implementering af den beskrevne metode indebærer valg af en Ca²⁺ indikator med ideelle egenskaber for det givne forskningsspørgsmål. Cytoplasmatiske Ca 2+ indikatorer har typisk en høj affinitet for Ca 2+, og følsomheden af disse indikatorer over for Ca²⁺ er omvendt relateret til kinetikken (on/off rate)^16,17. Det betyder, at enten Ca²⁺ følsomhed eller kinetik skal prioritere…

Materials

100x/1.40 Oil objective	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Objective	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
Beam homogenizer	Andor Technologies		Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table	TMC		With vibration control
Disposable culture tubes	VWR	47729-572	13 mm x 100 mm
Environmental chamber	Thermo Scientific	3940	Set to 20 °C
Filter wheel or slider	ASI		For 25 mm diameter filters
FJH 185	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 185	Worm strain
FJH 597	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 597	Worm strain
GFP bandpass emission filter	Chroma		525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner	Andor Technologies		4 laser lines
ILE solid state 488 nm laser	Andor Technologies		50 mW
ImageJ	National Institutes of Health		Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope	Olympus		With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera	Andor Technologies
Low auto-fluorescence immersion oil	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		Version 7.10.1
Microscope control box	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
pAS1	AddGene	194970	Plasmid
pBSKS	Stratagene
pCT61			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1	AddGene	194969	Plasmid
Polybead microspheres	Polysciences Inc.	00876-15	0.094 µm
Stability chamber	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	Set to 15 °C
Stage controller	ASI		With filter wheel control
Standard microscope slide	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller	Olympus		I3-TPC
Z-drift corrector	Olympus		IX3-ZDC2