Subcellulaire beeldvorming van neuronale calciumbehandeling in vivo

Summary

De huidige methoden beschrijven een niet-ratiometrische benadering voor hoge resolutie, sub-compartimentale calciumbeeldvorming in vivo in Caenorhabditis elegans met behulp van direct beschikbare genetisch gecodeerde calciumindicatoren.

Abstract

Calcium (Ca 2+) beeldvorming is grotendeels gebruikt om neuronale activiteit te onderzoeken, maar het wordt steeds duidelijker dat subcellulaire Ca²⁺ handling een cruciaal onderdeel is van intracellulaire signalering. De visualisatie van subcellulaire Ca²⁺ dynamica in vivo, waarbij neuronen kunnen worden bestudeerd in hun oorspronkelijke, intacte circuits, is technisch uitdagend gebleken in complexe zenuwstelsels. De transparantie en het relatief eenvoudige zenuwstelsel van de nematode Caenorhabditis elegans maken de celspecifieke expressie en in vivo visualisatie van fluorescerende tags en indicatoren mogelijk. Onder deze zijn fluorescerende indicatoren die zijn aangepast voor gebruik in het cytoplasma, evenals verschillende subcellulaire compartimenten, zoals de mitochondriën. Dit protocol maakt niet-ratiometrische Ca 2+ beeldvorming in vivo mogelijk met een subcellulaire resolutie die de analyse van Ca²⁺ dynamiek tot op het niveau van individuele dendritische stekels en mitochondriën mogelijk maakt. Hier worden twee beschikbare genetisch gecodeerde indicatoren met verschillende Ca 2+ affiniteiten gebruikt om het gebruik van dit protocol aan te tonen voor het meten van relatieve Ca²⁺ niveaus binnen het cytoplasma of mitochondriale matrix in een enkel paar exciterende interneuronen (AVA). Samen met de genetische manipulaties en longitudinale observaties die mogelijk zijn bij C. elegans, kan dit beeldvormingsprotocol nuttig zijn voor het beantwoorden van vragen over hoe Ca²⁺ behandeling de neuronale functie en plasticiteit reguleert.

Introduction

Calciumionen (Ca²⁺) zijn zeer veelzijdige dragers van informatie in veel celtypen. In neuronen is Ca²⁺ verantwoordelijk voor de activiteitsafhankelijke afgifte van neurotransmitters, de regulatie van cytoskeletale motiliteit, de fijnafstemming van metabole processen, evenals vele andere mechanismen die nodig zijn voor een goed neuronaal onderhoud en functie ^1,2. Om effectieve intracellulaire signalering te garanderen, moeten neuronen lage basale Ca^{2 +} -niveaus in hun cytoplasma³ handhaven. Dit wordt bereikt door coöperatieve Ca 2+ behandelingsmechanismen, waaronder de opname van Ca²⁺ in organellen zoals het endoplasmatisch reticulum (ER) en mitochondriën. Deze processen, naast de rangschikking van Ca 2⁺-permeabele ionkanalen in het plasmamembraan, resulteren in heterogene niveaus van cytoplasmatisch Ca²+ door het neuron.

Ca²⁺ heterogeniteit tijdens rust en neuronale activatie zorgt voor de diverse, locatiespecifieke regulatie van Ca²⁺-afhankelijke mechanismen¹. Een voorbeeld van de concentratiespecifieke effecten van Ca 2 + is de afgifte van Ca^{2 +} uit het ER via inositol 1,4,5-trisfosfaat (InsP₃) receptoren. Lage Ca²⁺ niveaus in combinatie met InsP₃ zijn vereist voor het openen van de calciumdoorlatende porie van de receptor. Als alternatief remmen hoge Ca²⁺ niveaus, zowel direct als indirect, de receptor⁴. Het belang van Ca 2+ homeostase voor een goede neuronale functie wordt ondersteund door bewijs dat suggereert dat verstoorde intracellulaire Ca²⁺ behandeling en signalering een vroege stap is in de pathogenese van neurodegeneratieve aandoeningen en natuurlijke veroudering ^5,6. In het bijzonder zijn abnormale Ca²⁺ opname en afgifte door het ER en mitochondriën gekoppeld aan het begin van neuronale disfunctie bij de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson en de ziekte van Huntington ^6,7.

De studie van Ca 2⁺ dyshomeostase tijdens natuurlijke veroudering of neurodegeneratie vereist de longitudinale observatie van Ca²⁺ niveaus met subcellulaire resolutie in een levend, intact organisme waarin de inheemse cellulaire architectuur (d.w.z. de rangschikking van synapsen en distributie van ionkanalen) wordt gehandhaafd. Hiertoe biedt dit protocol richtlijnen voor het gebruik van twee direct beschikbare, genetisch gecodeerde Ca 2+ sensoren voor het registreren van Ca²⁺ dynamica in vivo met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. De representatieve resultaten verkregen met behulp van de beschreven methode in C. elegans laten zien hoe de expressie van Ca 2+ indicatoren in het cytoplasma of mitochondriale matrix van afzonderlijke neuronen de snelle verwerving van fluorescerende beelden (tot 50 Hz) mogelijk kan maken die de Ca 2+ dynamiek illustreren met het extra vermogen om de Ca ²⁺ niveaus te onderscheiden binnen enkele wervelkolomachtige structuren en individuele mitochondriën.

Protocol

1. Transgene stammen creëren Met behulp van een kloonmethode naar keuze8,9, kloon expressievectoren om de Pflp-18 of Prig-3 promotor te bevatten (voor AVA-specifiek signaal in de ventrale zenuwstreng), gevolgd door de Ca2+ indicator naar keuze, en vervolgens een 3′ UTR (zie de discussie voor meer informatie)10. Een lijst van plasmiden en hun bronnen is te vinden in aanvullend…

Representative Results

Deze twee protocollen maken de snelle verwerving van differentiële Ca2+ niveaus binnen de subcellulaire regio’s en organellen van individuele neurieten in vivo met hoge ruimtelijke resolutie mogelijk. Het eerste protocol maakt het mogelijk om cytoplasmatisch Ca2+ te meten met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie. Dit wordt hier gedemonstreerd met behulp van de celspecifieke expressie van GCaMP6f in het glutamaterge AVA-commandointerneuronen 15, waarvan de neu…

Discussion

De eerste overweging bij het implementeren van de beschreven methode betreft de selectie van een Ca²⁺ indicator met ideale eigenschappen voor de gegeven onderzoeksvraag. Cytoplasmatische Ca 2+ indicatoren hebben doorgaans een hoge affiniteit voor Ca 2+, en de gevoeligheid van deze indicatoren voor Ca ²⁺ is omgekeerd evenredig met de kinetiek (aan/uit snelheid)^16,17. Dit betekent dat Ca²⁺ gevoeligheid of kinet…

Materials

100x/1.40 Oil objective	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Objective	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
Beam homogenizer	Andor Technologies		Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table	TMC		With vibration control
Disposable culture tubes	VWR	47729-572	13 mm x 100 mm
Environmental chamber	Thermo Scientific	3940	Set to 20 °C
Filter wheel or slider	ASI		For 25 mm diameter filters
FJH 185	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 185	Worm strain
FJH 597	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 597	Worm strain
GFP bandpass emission filter	Chroma		525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner	Andor Technologies		4 laser lines
ILE solid state 488 nm laser	Andor Technologies		50 mW
ImageJ	National Institutes of Health		Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope	Olympus		With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera	Andor Technologies
Low auto-fluorescence immersion oil	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		Version 7.10.1
Microscope control box	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
pAS1	AddGene	194970	Plasmid
pBSKS	Stratagene
pCT61			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1	AddGene	194969	Plasmid
Polybead microspheres	Polysciences Inc.	00876-15	0.094 µm
Stability chamber	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	Set to 15 °C
Stage controller	ASI		With filter wheel control
Standard microscope slide	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller	Olympus		I3-TPC
Z-drift corrector	Olympus		IX3-ZDC2