Субклеточная визуализация обработки кальция нейронами in vivo

Summary

Современные методы описывают нератиометрический подход к субкомпартментной визуализации кальция с высоким разрешением in vivo у Caenorhabditis elegans с использованием легкодоступных генетически кодируемых индикаторов кальция.

Abstract

Визуализация кальция (^Ca2+) в основном используется для изучения активности нейронов, но становится все более очевидным, что субклеточная обработка Ca²⁺ является важнейшим компонентом внутриклеточной передачи сигналов. Визуализация субклеточной динамики Ca²⁺ in vivo, где нейроны могут быть изучены в их нативной, интактной схеме, оказалась технически сложной в сложных нервных системах. Прозрачность и относительно простая нервная система нематоды Caenorhabditis elegans обеспечивают клеточно-специфическую экспрессию и визуализацию in vivo флуоресцентных меток и индикаторов. Среди них флуоресцентные индикаторы, которые были модифицированы для использования в цитоплазме, а также в различных субклеточных компартментах, таких как митохондрии. Этот протокол позволяет проводить нератиометрическую визуализацию^Ca2 + in vivo с субклеточным разрешением, что позволяет анализировать динамику Ca²⁺ вплоть до уровня отдельных дендритных шипов и митохондрий. Здесь используются два доступных генетически кодируемых индикатора с разным сродством к^Ca2 +, чтобы продемонстрировать использование этого протокола для измерения относительных уровней Ca²⁺ в цитоплазме или митохондриальном матриксе в одной паре возбуждающих интернейронов (AVA). Вместе с генетическими манипуляциями и продольными наблюдениями, возможными у C. elegans, этот протокол визуализации может быть полезен для ответа на вопросы о том, как обработка Ca²⁺ регулирует функцию и пластичность нейронов.

Introduction

Ионы кальция (^Ca2+) являются универсальными носителями информации во многих типах клеток. В нейронах Ca²⁺ отвечает за зависящее от активности высвобождение нейротрансмиттеров, регуляцию подвижности цитоскелета, тонкую настройку метаболических процессов, а также за многие другие механизмы, необходимые для правильного поддержания и функционирования нейронов ^1,2. Чтобы обеспечить эффективную внутриклеточную передачу сигналов, нейроны должны поддерживать низкий базальный уровень Ca²⁺ в своей цитоплазме³. Это достигается совместными механизмами обработки Ca2+, включая поглощение Ca²⁺ органеллами, такими как эндоплазматический ретикулум (ER) и митохондрии. Эти процессы, в дополнение к расположению Ca 2+-проницаемых ионных каналов в плазматической мембране, приводят к гетерогенным уровням цитоплазматического Ca²⁺ по всему нейрону.

Гетерогенность^Ca2+ во время покоя и активации нейронов обеспечивает разнообразную, специфическую для местоположения регуляцию Ca²⁺-зависимых механизмов¹. Одним из примеров специфических для концентрации эффектов Ca 2+ является высвобождение Ca ²⁺ из ER через рецепторы инозитол-1,4,5-трисфосфата (InsP 3). Низкие уровни Ca²⁺ в сочетании с InsP₃ необходимы для открытия кальций-проницаемой поры рецептора. В качестве альтернативы, высокие уровни Ca²⁺ как прямо, так и косвенно ингибируют рецептор⁴. Важность гомеостаза Ca 2+ для правильной функции нейронов подтверждается данными, свидетельствующими о том, что нарушение внутриклеточной обработки и передачи сигналов Ca²⁺ является ранним шагом в патогенезе нейродегенеративных расстройств и естественного старения ^5,6. В частности, аномальное поглощение и высвобождение Ca²⁺ скорой помощью и митохондриями связано с началом дисфункции нейронов при болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и болезни Хантингтона ^6,7.

Изучение дисгомеостаза Са 2+ при естественном старении или нейродегенерации требует продольного наблюдения уровней Са²⁺ с субклеточным разрешением в живом, интактном организме, в котором поддерживается нативная клеточная архитектура (т. е. расположение синапсов и распределение ионных каналов). С этой целью этот протокол содержит рекомендации по использованию двух легкодоступных, генетически закодированных датчиков Ca 2+ для записи динамики Ca²⁺ in vivo с высоким пространственным и временным разрешением. Репрезентативные результаты, полученные с помощью описанного метода у C. elegans, демонстрируют, как экспрессия показателей Ca 2+ в цитоплазме или митохондриальном матриксе отдельных нейронов может позволить быстро получать флуоресцентные изображения (до 50 Гц), которые иллюстрируют динамику Ca 2+ с дополнительной способностью различать уровни Ca ²⁺ в отдельных позвоночных структурах и отдельных митохондриях.

Protocol

1. Создание трансгенных штаммов Используя метод клонированияпо выбору 8,9, клонируйте векторы экспрессии, чтобы они содержали промотор Pflp-18 или Prig-3 (для AVA-специфического сигнала в вентральном нервном мозге), затем индикатор выбора Ca2+</…

Representative Results

Эти два протокола позволяют быстро получать дифференциальные уровни Ca2+ в субклеточных областях и органеллах отдельных нейритов in vivo с высоким пространственным разрешением. Первый протокол позволяет измерять цитоплазматический Ca2+ с высоким временным и пространствен…

Discussion

Первое соображение при реализации описанного метода связано с выбором показателя Ca²⁺ с идеальными характеристиками для данного вопроса исследования. Цитоплазматические показатели Ca2+ обычно имеют высокое сродство к Ca2+, а чувствительность этих показателей к^Ca2+ обратн?…

Materials

100x/1.40 Oil objective	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Objective	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
Beam homogenizer	Andor Technologies		Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table	TMC		With vibration control
Disposable culture tubes	VWR	47729-572	13 mm x 100 mm
Environmental chamber	Thermo Scientific	3940	Set to 20 °C
Filter wheel or slider	ASI		For 25 mm diameter filters
FJH 185	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 185	Worm strain
FJH 597	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 597	Worm strain
GFP bandpass emission filter	Chroma		525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner	Andor Technologies		4 laser lines
ILE solid state 488 nm laser	Andor Technologies		50 mW
ImageJ	National Institutes of Health		Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope	Olympus		With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera	Andor Technologies
Low auto-fluorescence immersion oil	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		Version 7.10.1
Microscope control box	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
pAS1	AddGene	194970	Plasmid
pBSKS	Stratagene
pCT61			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1	AddGene	194969	Plasmid
Polybead microspheres	Polysciences Inc.	00876-15	0.094 µm
Stability chamber	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	Set to 15 °C
Stage controller	ASI		With filter wheel control
Standard microscope slide	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller	Olympus		I3-TPC
Z-drift corrector	Olympus		IX3-ZDC2