विवो में न्यूरोनल कैल्शियम हैंडलिंग की उपकोशिकीय इमेजिंग
Summary
वर्तमान तरीकों में आसानी से उपलब्ध आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों का उपयोग करके केनोरहाब्डिस एलिगेंस में विवो में उच्च-रिज़ॉल्यूशन, उप-कंपार्टमेंटल कैल्शियम इमेजिंग के लिए एक गैर-अनुपातमीट्रिक दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है।
Abstract
कैल्शियम (सीए 2 +) इमेजिंग का उपयोग बड़े पैमाने पर न्यूरोनल गतिविधि की जांच करने के लिए किया गया है, लेकिन यह तेजी से स्पष्ट हो रहा है कि उपकोशिकीय सीए2 + हैंडलिंग इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग का एक महत्वपूर्ण घटक है। विवो में उपकोशिकीय सीए2 + गतिशीलता का विज़ुअलाइज़ेशन, जहां न्यूरॉन्स को उनके मूल, बरकरार सर्किटरी में अध्ययन किया जा सकता है, जटिल तंत्रिका तंत्र में तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है। नेमाटोड केनोरहाब्डिस एलिगेंस की पारदर्शिता और अपेक्षाकृत सरल तंत्रिका तंत्र सेल-विशिष्ट अभिव्यक्ति और फ्लोरोसेंट टैग और संकेतकों के विवो विज़ुअलाइज़ेशन में सक्षम करता है। इनमें फ्लोरोसेंट संकेतक हैं जिन्हें साइटोप्लाज्म के साथ-साथ माइटोकॉन्ड्रिया जैसे विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बों में उपयोग के लिए संशोधित किया गया है। यह प्रोटोकॉल एक उपकोशिकीय संकल्प के साथ विवो में गैर-अनुपातमीट्रिक सीए 2 + इमेजिंग को सक्षम करता है जो व्यक्तिगत डेंड्राइटिक स्पाइन और माइटोकॉन्ड्रिया के स्तर तक सीए2 + गतिशीलता के विश्लेषण की अनुमति देता है। यहां, विभिन्न सीए 2 + समानताओं के साथ दो उपलब्ध आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड संकेतकों का उपयोग उत्तेजक इंटरन्यूरॉन (एवीए) की एक जोड़ी में साइटोप्लाज्म या माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स के भीतर सापेक्ष सीए2 + स्तरों को मापने के लिए इस प्रोटोकॉल के उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है। एलिगेंस में संभव आनुवंशिक जोड़तोड़ और अनुदैर्ध्य टिप्पणियों के साथ, यह इमेजिंग प्रोटोकॉल इस बारे में सवालों के जवाब देने के लिए उपयोगी हो सकता है कि सीए2 + हैंडलिंग न्यूरोनल फ़ंक्शन और प्लास्टिसिटी को कैसे नियंत्रित करता है।
Introduction
कैल्शियम आयन (सीए2 +) कई सेल प्रकारों में जानकारी के अत्यधिक बहुमुखी वाहक हैं। न्यूरॉन्स में, सीए 2 + न्यूरोट्रांसमीटर की गतिविधि-निर्भर रिहाई, साइटोस्केलेटल गतिशीलता के विनियमन, चयापचय प्रक्रियाओं की बारीक-ट्यूनिंग, साथ ही उचित न्यूरोनल रखरखाव और कार्य 1,2 के लिए आवश्यक कई अन्य तंत्रों के लिए जिम्मेदार है। प्रभावी इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग सुनिश्चित करने के लिए, न्यूरॉन्स को अपने साइटोप्लाज्म3 में कम बेसल सीए2 + स्तर बनाए रखना चाहिए। यह सहकारी सीए 2 + हैंडलिंग तंत्र द्वारा पूरा किया जाता है, जिसमें एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) और माइटोकॉन्ड्रिया जैसे ऑर्गेनेल में सीए2 + का उत्थान शामिल है। ये प्रक्रियाएं, प्लाज्मा झिल्ली में सीए 2 + -पारगम्य आयन चैनलों की व्यवस्था के अलावा, पूरे न्यूरॉन में साइटोप्लाज्मिक सीए2 + के विषम स्तर के परिणामस्वरूप होती हैं।
आराम और न्यूरोनल सक्रियण के दौरान सीए 2 + विषमता सीए2 + -निर्भर तंत्र1 के विविध, स्थान-विशिष्ट विनियमन की अनुमति देती है। सीए 2 + के एकाग्रता-विशिष्ट प्रभावों का एक उदाहरण इनोसिटोल 1,4,5-ट्राइस्फॉस्फेट (आईएनएसपी3) रिसेप्टर्स के माध्यम से ईआर से सीए2 + की रिहाई है। रिसेप्टर के कैल्शियम-पारगम्य छिद्र के उद्घाटन के लिए आईएनएसपी3 के साथ संयोजन में कम सीए2 + स्तर की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक रूप से, उच्च सीए2 + स्तर प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष रूप से रिसेप्टर4 को रोकते हैं। उचित न्यूरोनल फ़ंक्शन के लिए सीए 2 + होमियोस्टैसिस का महत्व सबूतों से समर्थित है जो बताते हैं कि बाधित इंट्रासेल्युलर सीए2 + हैंडलिंग और सिग्नलिंग न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों औरप्राकृतिक उम्र बढ़ने 5,6 के रोगजनन में एक प्रारंभिक कदम है। विशेष रूप से, ईआर और माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा असामान्य सीए2 + अपटेक और रिलीज अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग और हंटिंगटन रोग 6,7 में न्यूरोनल डिसफंक्शन की शुरुआत से जुड़ा हुआ है।
प्राकृतिक उम्र बढ़ने या न्यूरोडीजेनेरेशन के दौरान सीए 2 + डिस्होमोस्टेसिस के अध्ययन के लिए एक जीवित, बरकरार जीव में उपकोशिकीय संकल्प के साथ सीए2 + स्तरों के अनुदैर्ध्य अवलोकन की आवश्यकता होती है जिसमें देशी सेलुलर वास्तुकला (यानी, सिनैप्स की व्यवस्था और आयन चैनलों का वितरण) बनाए रखा जाता है। इसके लिए, यह प्रोटोकॉल उच्च स्थानिक और लौकिक रिज़ॉल्यूशन के साथ विवो में सीए 2 + गतिशीलता को रिकॉर्ड करने के लिए दो आसानी से उपलब्ध, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए2 + सेंसर के उपयोग पर मार्गदर्शन प्रदान करता है। एलिगेंस में वर्णित विधि का उपयोग करके प्राप्त प्रतिनिधि परिणाम दर्शाते हैं कि एकल न्यूरॉन्स के साइटोप्लाज्म या माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में सीए 2 + संकेतकों की अभिव्यक्ति फ्लोरोसेंट छवियों (50 हर्ट्ज तक) के तेजी से अधिग्रहण की अनुमति दे सकती है जो एकल रीढ़ जैसी संरचनाओं और व्यक्तिगत माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर सीए 2 + स्तरों को समझने की अतिरिक्त क्षमता के साथ सीए 2 + गतिशीलता को चित्रित करती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित विधि को लागू करते समय पहले विचार में दिए गए शोध प्रश्न के लिए आदर्श विशेषताओं के साथ सीए2 + संकेतक का चयन शामिल है। साइटोप्लाज्मिक सीए 2 + संकेतकों में आमतौर पर सीए 2 + के लिए एक उच्च संबंध होता है,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) (आर 01- एनएस 115947 एफ होर्न्डली को सम्मानित) द्वारा समर्थित किया गया था। हम पीएएस 1 प्लास्मिड के लिए डॉ अटिला स्टेटक को भी धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| 100x/1.40 Oil objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 10x/0.40 Objective | Olympus | UPlanSApo | |
| 22 mm x 22 mm Cover glass | VWR | 48366-227 | |
| Agarose SFR | VWR | J234-100G | |
| Beam homogenizer | Andor Technologies | Borealis upgrade to CSU-X1 | |
| CleanBench laboratory table | TMC | With vibration control | |
| Disposable culture tubes | VWR | 47729-572 | 13 mm x 100 mm |
| Environmental chamber | Thermo Scientific | 3940 | Set to 20 °C |
| Filter wheel or slider | ASI | For 25 mm diameter filters | |
| FJH 185 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 185 | Worm strain |
| FJH 597 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 597 | Worm strain |
| GFP bandpass emission filter | Chroma | 525 ± 50 nm (25 mm diameter) | |
| ILE laser combiner | Andor Technologies | 4 laser lines | |
| ILE solid state 488 nm laser | Andor Technologies | 50 mW | |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52a | |
| IX83 Spinning disk confocal microscope | Olympus | With Yokogawa CSU-X1 spinning disc | |
| iXon Ultra EMCCD camera | Andor Technologies | ||
| Low auto-fluorescence immersion oil | Olympus | Z-81226 | |
| MetaMorph | Molecular Devices | Version 7.10.1 | |
| Microscope control box | Olympus | IX3-CBH | |
| Muscimol | MP Biomedical / Sigma | 02195336-CF | |
| pAS1 | AddGene | 194970 | Plasmid |
| pBSKS | Stratagene | ||
| pCT61 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pJM23 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
| pKK1 | AddGene | 194969 | Plasmid |
| Polybead microspheres | Polysciences Inc. | 00876-15 | 0.094 µm |
| Stability chamber | Norlake Scientific | NSRI241WSW/8H | Set to 15 °C |
| Stage controller | ASI | With filter wheel control | |
| Standard microscope slide | Premiere | 9108W-E | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Touch panel controller | Olympus | I3-TPC | |
| Z-drift corrector | Olympus | IX3-ZDC2 |
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