Subcellulær avbildning av nevronal kalsiumhåndtering in vivo

Summary

De nåværende metodene beskriver en ikke-ratiometrisk tilnærming for høyoppløselig, subkompartmental kalsiumavbildning in vivo i Caenorhabditis elegans ved bruk av lett tilgjengelige genetisk kodede kalsiumindikatorer.

Abstract

Avbildning av kalsium (Ca 2+) har i stor grad blitt brukt til å undersøke nevronaktivitet, men det blir stadig tydeligere at subcellulær Ca²⁺-håndtering er en avgjørende komponent i intracellulær signalering. Visualiseringen av subcellulær Ca²⁺ dynamikk in vivo, hvor nevroner kan studeres i deres innfødte, intakte kretser, har vist seg teknisk utfordrende i komplekse nervesystemer. Gjennomsiktigheten og det relativt enkle nervesystemet til nematoden Caenorhabditis elegans muliggjør cellespesifikt uttrykk og in vivo visualisering av fluorescerende koder og indikatorer. Blant disse er fluorescerende indikatorer som er modifisert for bruk i cytoplasma, samt forskjellige subcellulære rom, som mitokondriene. Denne protokollen muliggjør ikke-ratiometrisk Ca 2+-avbildning in vivo med en subcellulær oppløsning som tillater analyse av Ca²⁺-dynamikk ned til nivået av individuelle dendrittiske pigger og mitokondrier. Her brukes to tilgjengelige genetisk kodede indikatorer med forskjellige Ca 2+ affiniteter for å demonstrere bruken av denne protokollen for å måle relative Ca²⁺ nivåer i cytoplasma eller mitokondriematrisen i et enkelt par eksitatoriske interneuroner (AVA). Sammen med de genetiske manipulasjonene og longitudinelle observasjonene som er mulige i C. elegans, kan denne bildeprotokollen være nyttig for å svare på spørsmål om hvordan Ca²⁺ -håndtering regulerer nevronfunksjon og plastisitet.

Introduction

Kalsiumioner (Ca²⁺) er svært allsidige bærere av informasjon i mange celletyper. I nevroner er Ca²⁺ ansvarlig for aktivitetsavhengig frigjøring av nevrotransmittere, regulering av cytoskeletal motilitet, finjustering av metabolske prosesser, samt mange andre mekanismer som kreves for riktig nevronvedlikehold og funksjon ^1,2. For å sikre effektiv intracellulær signalering må nevroner opprettholde lave basale Ca²⁺ nivåer i deres cytoplasma³. Dette oppnås ved kooperative Ca 2+ håndteringsmekanismer, inkludert opptak av Ca²⁺ i organeller som endoplasmatisk retikulum (ER) og mitokondrier. Disse prosessene, i tillegg til arrangementet av Ca 2⁺-permeable ionekanaler i plasmamembranen, resulterer i heterogene nivåer av cytoplasmatisk Ca²⁺ gjennom nevronet.

Ca 2⁺ heterogenitet under hvile og nevronaktivering muliggjør mangfoldig, stedsspesifikk regulering av Ca²⁺-avhengige mekanismer¹. Et eksempel på de konsentrasjonsspesifikke effektene av Ca 2 + er frigjøring av Ca^{2 +} fra ER gjennom inositol 1,4,5-trisfosfat (InsP₃) reseptorer. Lave Ca²⁺ nivåer i kombinasjon med InsP₃ er nødvendig for åpning av reseptorens kalsiumgjennomtrengelige pore. Alternativt hemmer høye Ca²⁺ nivåer både direkte og indirekte reseptoren⁴. Betydningen av Ca 2+ homeostase for riktig nevronfunksjon støttes av bevis som tyder på at forstyrret intracellulær Ca²⁺ håndtering og signalering er et tidlig skritt i patogenesen av nevrodegenerative lidelser og naturlig aldring ^5,6. Spesielt er unormalt Ca²⁺ opptak og frigjøring av ER og mitokondrier knyttet til utbruddet av nevronal dysfunksjon i Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom og Huntingtons sykdom ^6,7.

Studien av Ca 2+ dyshomeostase under naturlig aldring eller nevrodegenerasjon krever langsgående observasjon av Ca²⁺ nivåer med subcellulær oppløsning i en levende, intakt organisme der den opprinnelige cellulære arkitekturen (dvs. arrangementet av synapser og distribusjon av ionkanaler) opprettholdes. For dette formål gir denne protokollen veiledning om bruk av to lett tilgjengelige, genetisk kodede Ca 2+ sensorer for registrering av Ca²⁺ dynamikk in vivo med høy romlig og tidsmessig oppløsning. De representative resultatene som er oppnådd ved hjelp av den beskrevne metoden i C. elegans, demonstrerer hvordan ekspresjonen av Ca²⁺ indikatorer i cytoplasma eller mitokondriell matrise av enkeltneuroner kan tillate rask oppkjøp av fluorescerende bilder (opptil 50 Hz) som illustrerer Ca 2 + dynamikken med den ekstra evnen til å skille Ca^{2 +} nivåer innenfor enkelte ryggradslignende strukturer og individuelle mitokondrier.

Protocol

1. Opprette transgene stammer Ved hjelp av en valgfri metode 8,9, klon ekspresjonsvektorer for å inneholde Pflp-18 eller Prig-3 promotoren (for AVA-spesifikt signal i ventral nervestreng), etterfulgt av Ca2+ indikator for valg, og deretter en 3′ UTR (se diskusjonen for mer informasjon)10. En liste over plasmider og deres kilder finnes i tilleggstabell 1. F?…

Representative Results

Disse to protokollene muliggjør rask oppkjøp av differensial Ca2+ nivåer innenfor de subcellulære områdene og organeller av individuelle neuritter in vivo med høy romlig oppløsning. Den første protokollen tillater måling av cytoplasmatisk Ca2+ med høy temporal og romlig oppløsning. Dette demonstreres her ved å bruke det cellespesifikke uttrykket av GCaMP6f i de glutamatergiske AVA-kommandointernevronene15, hvis nevritter løper hele lengden av den ventral…

Discussion

Den første vurderingen ved implementering av metoden som er beskrevet, innebærer valg av en Ca²⁺ indikator med ideelle egenskaper for det gitte forskningsspørsmålet. Cytoplasmatiske Ca 2+-indikatorer har vanligvis høy affinitet for Ca 2+, og sensitiviteten til disse indikatorene til Ca ²⁺ er omvendt relatert til kinetikken (på/av-hastighet)^16,17. Dette betyr at enten Ca²⁺ følsomhet eller kinetikk må p…

Materials

100x/1.40 Oil objective	Olympus		UPlanSApo
10x/0.40 Objective	Olympus		UPlanSApo
22 mm x 22 mm Cover glass	VWR	48366-227
Agarose SFR	VWR	J234-100G
Beam homogenizer	Andor Technologies		Borealis upgrade to CSU-X1
CleanBench laboratory table	TMC		With vibration control
Disposable culture tubes	VWR	47729-572	13 mm x 100 mm
Environmental chamber	Thermo Scientific	3940	Set to 20 °C
Filter wheel or slider	ASI		For 25 mm diameter filters
FJH 185	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 185	Worm strain
FJH 597	Caenorhabditis Genetics Center	FJH 597	Worm strain
GFP bandpass emission filter	Chroma		525 ± 50 nm (25 mm diameter)
ILE laser combiner	Andor Technologies		4 laser lines
ILE solid state 488 nm laser	Andor Technologies		50 mW
ImageJ	National Institutes of Health		Version 1.52a
IX83 Spinning disk confocal microscope	Olympus		With Yokogawa CSU-X1 spinning disc
iXon Ultra EMCCD camera	Andor Technologies
Low auto-fluorescence immersion oil	Olympus	Z-81226
MetaMorph	Molecular Devices		Version 7.10.1
Microscope control box	Olympus		IX3-CBH
Muscimol	MP Biomedical / Sigma	02195336-CF
pAS1	AddGene	194970	Plasmid
pBSKS	Stratagene
pCT61			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pJM23			Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request
pKK1	AddGene	194969	Plasmid
Polybead microspheres	Polysciences Inc.	00876-15	0.094 µm
Stability chamber	Norlake Scientific	NSRI241WSW/8H	Set to 15 °C
Stage controller	ASI		With filter wheel control
Standard microscope slide	Premiere	9108W-E	75 mm x 25 mm x 1 mm
Touch panel controller	Olympus		I3-TPC
Z-drift corrector	Olympus		IX3-ZDC2