De nuvarande metoderna beskriver en icke-ratiometrisk metod för högupplöst, subkompartmentell kalciumavbildning in vivo i Caenorhabditis elegans med hjälp av lättillgängliga genetiskt kodade kalciumindikatorer.
Kalcium (Ca2+) avbildning har till stor del använts för att undersöka neuronal aktivitet, men det blir allt tydligare att subcellulär Ca2 + hantering är en avgörande komponent i intracellulär signalering. Visualiseringen av subcellulär Ca2+ dynamik in vivo, där neuroner kan studeras i sina infödda, intakta kretsar, har visat sig vara tekniskt utmanande i komplexa nervsystem. Transparensen och det relativt enkla nervsystemet hos nematoden Caenorhabditis elegans möjliggör cellspecifikt uttryck och in vivo-visualisering av fluorescerande taggar och indikatorer. Bland dessa är fluorescerande indikatorer som har modifierats för användning i cytoplasman såväl som olika subcellulära fack, såsom mitokondrier. Detta protokoll möjliggör icke-ratiometrisk Ca 2+ avbildning in vivo med en subcellulär upplösning som möjliggör analys av Ca2+ dynamik ner till nivån för enskilda dendritiska ryggar och mitokondrier. Här används två tillgängliga genetiskt kodade indikatorer med olika Ca 2+ affiniteter för att demonstrera användningen av detta protokoll för att mäta relativa Ca2+ nivåer inom cytoplasman eller mitokondriell matris i ett enda par excitatoriska interneuroner (AVA). Tillsammans med de genetiska manipulationer och longitudinella observationer som är möjliga i C. elegans kan detta avbildningsprotokoll vara användbart för att svara på frågor om hur Ca2+ hantering reglerar neuronal funktion och plasticitet.
Kalciumjoner (Ca2+) är mycket mångsidiga bärare av information i många celltyper. I neuroner är Ca2+ ansvarig för den aktivitetsberoende frisättningen av neurotransmittorer, regleringen av cytoskeletal motilitet, finjustering av metaboliska processer, liksom många andra mekanismer som krävs för korrekt neuronalt underhåll och funktion 1,2. För att säkerställa effektiv intracellulär signalering måste neuroner upprätthålla låga basala Ca2+ nivåer i sin cytoplasma3. Detta uppnås genom kooperativa Ca 2+ hanteringsmekanismer, inklusive upptag av Ca2+ i organeller såsom endoplasmatisk retikulum (ER) och mitokondrier. Dessa processer, förutom arrangemanget av Ca2+-permeabla jonkanaler i plasmamembranet, resulterar i heterogena nivåer av cytoplasmatiskCa2+ i hela neuronen.
Ca 2+ heterogenitet under vila och neuronal aktivering möjliggör mångfaldig, platsspecifik reglering av Ca2+-beroende mekanismer 1. Ett exempel på de koncentrationsspecifika effekterna av Ca 2+ är frisättningen av Ca2+ från ER genom inositol 1,4,5-trisfosfat (InsP3) receptorer. Låga Ca2+ nivåer i kombination med InsP3 krävs för öppning av receptorns kalciumpermeabla porer. Alternativt hämmar höga Ca2+ nivåer både direkt och indirekt receptorn4. Betydelsen av Ca 2+ homeostas för korrekt neuronal funktion stöds av bevis som tyder på att störd intracellulär Ca2+ hantering och signalering är ett tidigt steg i patogenesen av neurodegenerativa störningar och naturligt åldrande 5,6. Specifikt är onormalt upptag och frisättning av Ca2+ av ER och mitokondrier kopplade till uppkomsten av neuronal dysfunktion vid Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom och Huntingtons sjukdom 6,7.
Studien av Ca 2+ dyshomeostas under naturligt åldrande eller neurodegeneration kräver longitudinell observation av Ca2+ nivåer med subcellulär upplösning i en levande, intakt organism där den ursprungliga cellulära arkitekturen (dvs arrangemanget av synapser och distribution av jonkanaler) upprätthålls. För detta ändamål ger detta protokoll vägledning om användningen av två lättillgängliga, genetiskt kodade Ca 2+ sensorer för inspelning av Ca2+ dynamik in vivo med hög rumslig och tidsmässig upplösning. De representativa resultaten som förvärvats med den beskrivna metoden i C. elegans visar hur uttrycket av Ca 2+ indikatorer i cytoplasman eller mitokondriell matris av enskilda neuroner kan möjliggöra snabb förvärv av fluorescerande bilder (upp till 50 Hz) som illustrerar Ca 2+ dynamiken med den ytterligare förmågan att urskilja Ca 2+ nivåer inom enskilda ryggradsliknande strukturer och individuella mitokondrier.
Det första övervägandet vid implementering av den beskrivna metoden innefattar val av en Ca2+ indikator med ideala egenskaper för den givna forskningsfrågan. Cytoplasmatiska Ca 2+ indikatorer har vanligtvis en hög affinitet för Ca 2+, och känsligheten hos dessa indikatorer för Ca 2+ är omvänt relaterad till kinetiken (på / av-hastighet) 16,17. Detta innebär att antingen Ca2+ känslighet eller kin…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) (R01- NS115947 tilldelad F. Hoerndli). Vi vill också tacka Dr. Attila Stetak för plasmiden pAS1.
100x/1.40 Oil objective | Olympus | UPlanSApo | |
10x/0.40 Objective | Olympus | UPlanSApo | |
22 mm x 22 mm Cover glass | VWR | 48366-227 | |
Agarose SFR | VWR | J234-100G | |
Beam homogenizer | Andor Technologies | Borealis upgrade to CSU-X1 | |
CleanBench laboratory table | TMC | With vibration control | |
Disposable culture tubes | VWR | 47729-572 | 13 mm x 100 mm |
Environmental chamber | Thermo Scientific | 3940 | Set to 20 °C |
Filter wheel or slider | ASI | For 25 mm diameter filters | |
FJH 185 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 185 | Worm strain |
FJH 597 | Caenorhabditis Genetics Center | FJH 597 | Worm strain |
GFP bandpass emission filter | Chroma | 525 ± 50 nm (25 mm diameter) | |
ILE laser combiner | Andor Technologies | 4 laser lines | |
ILE solid state 488 nm laser | Andor Technologies | 50 mW | |
ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.52a | |
IX83 Spinning disk confocal microscope | Olympus | With Yokogawa CSU-X1 spinning disc | |
iXon Ultra EMCCD camera | Andor Technologies | ||
Low auto-fluorescence immersion oil | Olympus | Z-81226 | |
MetaMorph | Molecular Devices | Version 7.10.1 | |
Microscope control box | Olympus | IX3-CBH | |
Muscimol | MP Biomedical / Sigma | 02195336-CF | |
pAS1 | AddGene | 194970 | Plasmid |
pBSKS | Stratagene | ||
pCT61 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
pJM23 | Plasmid available from Hoerndli/Maricq lab upon request | ||
pKK1 | AddGene | 194969 | Plasmid |
Polybead microspheres | Polysciences Inc. | 00876-15 | 0.094 µm |
Stability chamber | Norlake Scientific | NSRI241WSW/8H | Set to 15 °C |
Stage controller | ASI | With filter wheel control | |
Standard microscope slide | Premiere | 9108W-E | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
Touch panel controller | Olympus | I3-TPC | |
Z-drift corrector | Olympus | IX3-ZDC2 |