Ferrichlorid-induceret arteriel trombose og prøveindsamling til 3D-elektronmikroskopianalyse
Summary
Denne protokol beskriver, hvordan man bruger en FeCl3-medieret skade til at inducere arteriel trombose, og hvordan man indsamler og forbereder arterielle skadeprøver på forskellige stadier af trombose til elektronmikroskopianalyse.
Abstract
Hjerte-kar-sygdomme er en førende årsag til dødelighed og sygelighed på verdensplan. Afvigende trombose er et fælles træk ved systemiske tilstande som diabetes og fedme og kroniske inflammatoriske sygdomme som aterosklerose, kræft og autoimmune sygdomme. Ved vaskulær skade virker normalt koagulationssystemet, blodpladerne og endotelet på en orkestreret måde for at forhindre blødning ved at danne en blodprop på skadestedet. Abnormiteter i denne proces fører til enten overdreven blødning eller ukontrolleret trombose/utilstrækkelig antitrombotisk aktivitet, hvilket udmønter sig i karokklusion og dens følgevirkninger. FeCl 3-induceret carotisskademodel er et værdifuldt værktøj til at undersøge, hvordan trombose initierer og udvikler sig in vivo. Denne model involverer endotelskader / denudation og efterfølgende koagulationsdannelse på det skadede sted. Det giver et meget følsomt, kvantitativt assay til overvågning af vaskulær skade og koagulationsdannelse som reaktion på forskellige grader af vaskulær skade. Når den er optimeret, kan denne standardteknik bruges til at studere de molekylære mekanismer, der ligger til grund for trombose, såvel som de ultrastrukturelle ændringer i blodplader i en voksende trombose. Dette assay er også nyttigt til at studere effekten af antitrombotiske og antiplatelet midler. Denne artikel forklarer, hvordan man initierer og overvåger FeCl 3-induceret arteriel trombose, og hvordan man indsamler prøver til analyse ved elektronmikroskopi.
Introduction
Trombose er dannelsen af en blodprop, der helt eller delvis blokerer et blodkar, hvilket hæmmer blodets naturlige strømning. Dette fører til alvorlige og dødelige kardiovaskulære hændelser, såsom iskæmisk hjertesygdom og slagtilfælde. Hjerte-kar-sygdomme er den hyppigste årsag til sygelighed og dødelighed og forårsager et ud af fire dødsfald på verdensplan 1,2,3. Selvom trombose manifesteres som en funktionsfejl i vaskulærsystemet, kan det være et resultat af en underliggende mikrobiel eller viral infektion, immunforstyrrelse, malignitet eller metabolisk tilstand. Blodstrømmen opretholdes af den komplekse interaktion mellem forskellige komponenter i vaskulærsystemet, herunder endotelceller, røde / hvide blodlegemer, blodplader og koagulationsfaktorer4. Ved vaskulær skade interagerer blodplader med klæbende proteiner på subendotelmatrixen og frigiver deres granulære indhold, som rekrutterer flere blodplader5. Samtidig aktiveres koagulationskaskaden, hvilket fører til fibrindannelse og aflejring. I sidste ende dannes en blodprop, der indeholder blodplader og røde blodlegemer fanget i et fibrinnet6. Selvom antiplatelet og antikoagulerende lægemidler er tilgængelige for at modulere trombose, er falsk blødning fortsat et stort problem med disse terapier, hvilket kræver finjustering af doser og kombinationer af disse lægemidler. Der er således stadig et presserende behov for at opdage nye antitrombotiske lægemidler7.
Trombose undersøges ved hjælp af flere metoder til at påføre vaskulær skade: mekanisk (karligering), termisk (laserskade) og kemisk skade (FeCl3 / Rose Bengal applikation). Trombosens art varierer afhængigt af placeringen (arteriel vs. venøs), metode eller omfang af skaden. Blandt alle disse typer er FeCl 3-induceret vaskulær skade den mest anvendte metode. Det har været anvendt i mus, rotter, kaniner, marsvin og hunde 8,9,10,11,12. Metoden er relativt enkel, nem at bruge, og hvis vigtige parametre er standardiserede, er den følsom og reproducerbar i forskellige vaskulære systemer (fx arterier [carotis og lårben], vener [jugular] og arterioler [cremaster og mesenteric]) (supplerende tabel 1).
Denne model kan også bruges til at fremme vores forståelse af koagulationsdannelsens mekanik og morfologi. Denne teknik giver unikt fordelen ved at stoppe trombose ved forskellige strømningshastighedspunkter for at studere de mellemliggende stadier af processen, før den bliver okklusiv. Nylige fremskridt inden for tromboseforskning har brugt denne model til at fokusere opmærksomheden på ikke-farmakologiske metoder til trombolyse13 eller ikke-invasiv levering af antitrombotiske og / eller fibrinolytiske midler14,15. Flere grupper har vist, at når blodplademembraner er belagt med disse behandlinger, kan lægemidlerne aktiveres ved termisk stimulering for at målrette blodpropper16. De teknikker, der er beskrevet her, kan være nyttige for sådanne undersøgelser som validering af deres resultater på enkelt blodpladeniveau. I dette manuskript beskriver protokol 1 den grundlæggende FeCl3-medierede vaskulære skadeprocedure, mens protokol 2 beskriver metoden til indsamling og fiksering af den vaskulære skadeprøve til yderligere analyse ved elektronmikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den topiske anvendelse af FeCl3 til vaskulaturen for at inducere trombose er en meget anvendt teknik og har været medvirkende til at etablere roller for forskellige blodpladereceptorer, ligandsignalveje og deres hæmmere20,21,22,23. Mekanismen, hvorigennemFeCl3 forårsager trombose, er mangefacetteret; Tidligere blev endoteldenudation betragtet som en årsag til trombose…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker medlemmerne af Whiteheart Laboratory for deres omhyggelige gennemlæsning af dette manuskript. Arbejdet blev støttet af tilskud fra NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 og HL150818) og en Department of Veterans Affairs Merit Award til S.W.W., R01 HL 155519 til BS og NIBIB intramural programtilskud til RDL.
Materials
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1×2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Palta, S., Saroa, R., Palta, A. Overview of the coagulation system. Indian Journal of Anaesthesia. 58 (5), 515-523 (2014).
- Joshi, S., Whiteheart, S. W. The nuts and bolts of the platelet release reaction. Platelets. 28 (2), 129-137 (2017).
- Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis. International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).
- Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice. Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
- Denis, C. V., et al. Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).
- Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).
- Kato, Y., et al. Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig. European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).
- Huttinger, A. L., et al. Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury. Journal of Visualized Experiments. (139), e57981 (2018).
- Zhang, W., et al. Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets. Small. 18 (15), 2106252 (2022).
- Liu, B., et al. Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration. Small. , 2205260 (2022).
- Refaat, A., et al. Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis. Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).
- Li, S., et al. Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation. Small. 18 (51), 2203184 (2022).
- Subramaniam, S., Kanse, S. M. Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).
- Cocchiaro, J. L., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Valdivia, R. H. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (27), 9379-9384 (2008).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric-estimation from incomplete observations. Journal of the American Statistical Association. 53 (282), 457-481 (1958).
- Chauhan, A. K., Kisucka, J., Lamb, C. B., Bergmeier, W., Wagner, D. D. von Willebrand factor and factor VIII are independently required to form stable occlusive thrombi in injured veins. Blood. 109 (6), 2424-2429 (2007).
- Andre, P., et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin–dependent mechanism. Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).
- Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 385-392 (2000).
- Bergmeier, W., et al. The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16900-16905 (2006).
- Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126 (6), 817-824 (2015).
- Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).
- Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).
- Shim, Y., et al. Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration. Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).
- Ghosh, S., et al. Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models. PLoS One. 16 (10), 0258192 (2021).
- Wilbs, J., et al. Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs. Nature Communications. 11 (1), 3890 (2020).
- Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).
- Jacob-Ferreira, A. L., et al. Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).
- Zhou, X., et al. A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).
- Yang, X., et al. Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis. BioMed Research International. 2022, 4893859 (2022).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
- Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. Journal of Visualized Experiments. (115), e54479 (2016).
- Holly, S. P., et al. Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis. Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).
- Bird, J. E., et al. Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis. Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).
