Артериальный тромбоз, индуцированный хлоридом железа, и сбор образцов для анализа 3D-электронной микроскопии
Summary
Настоящий протокол описывает, как использовать FeCl-3-опосредованное повреждение для индукции артериального тромбоза, а также как собирать и подготавливать образцы артериального повреждения на различных стадиях тромбоза для анализа электронной микроскопии.
Abstract
Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из основных причин смертности и заболеваемости во всем мире. Аберрантный тромбоз является общей чертой системных состояний, таких как диабет и ожирение, а также хронических воспалительных заболеваний, таких как атеросклероз, рак и аутоиммунные заболевания. При повреждении сосудов обычно свертывающая система, тромбоциты и эндотелий действуют организованно, чтобы предотвратить кровотечение, образуя сгусток в месте повреждения. Аномалии в этом процессе приводят либо к чрезмерному кровотечению, либо к неконтролируемому тромбозу / недостаточной антитромботической активности, что приводит к окклюзии сосудов и ее последствиям. Модель повреждения сонной артерии, индуцированная FeCl3, является ценным инструментом для исследования того, как тромбоз инициируется и прогрессирует in vivo. Эта модель включает повреждение / денудацию эндотелия и последующее образование сгустка в поврежденном месте. Он обеспечивает высокочувствительный количественный анализ для мониторинга повреждения сосудов и образования сгустков в ответ на различные степени повреждения сосудов. После оптимизации этот стандартный метод может быть использован для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе тромбоза, а также ультраструктурных изменений тромбоцитов в растущем тромбе. Этот анализ также полезен для изучения эффективности антитромботических и антиагрегантных средств. В этой статье объясняется, как инициировать и контролировать FeCl-3-индуцированный артериальный тромбоз и как собирать образцы для анализа с помощью электронной микроскопии.
Introduction
Тромбоз – это образование сгустка крови, который частично или полностью блокирует кровеносный сосуд, препятствуя естественному току крови. Это приводит к тяжелым и смертельным сердечно-сосудистым событиям, таким как ишемическая болезнь сердца и инсульты. Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной заболеваемости и смертности и являются причиной каждой четвертой смерти во всем мире 1,2,3. Хотя тромбоз проявляется как нарушение работы сосудистой системы, он может быть результатом основной микробной или вирусной инфекции, иммунного расстройства, злокачественных новообразований или метаболического состояния. Кровоток поддерживается сложным взаимодействием между различными компонентами сосудистой системы, включая эндотелиальные клетки, эритроциты/лейкоциты, тромбоциты и факторы свертываниякрови 4. При повреждении сосудов тромбоциты взаимодействуют с адгезивными белками на субэндотелиальном матриксе и высвобождают свое зернистое содержимое, которое набирает больше тромбоцитов5. Одновременно активируется каскад коагуляции, что приводит к образованию и отложению фибрина. В конечном итоге образуется сгусток, содержащий тромбоциты и эритроциты, попавшие в фибриновую сетку6. Хотя антиагреганты и антикоагулянты доступны для модуляции тромбоза, ложные кровотечения остаются серьезной проблемой при этих методах лечения, требуя точной настройки дозировок и комбинаций этих препаратов. Таким образом, по-прежнему существует острая необходимость в открытии новых антитромботическихпрепаратов7.
Тромбоз изучается с использованием нескольких методов нанесения сосудистого повреждения: механического (перевязка сосудов), термического (лазерная травма) и химического повреждения (применение FeCl3 / Rose Bengal). Характер тромбоза варьируется в зависимости от локализации (артериальная или венозная), метода или степени повреждения. Среди всех этих типов FeCl-3-индуцированное повреждение сосудов является наиболее широко используемым методом. Он использовался у мышей, крыс, кроликов, морских свинок и собак 8,9,10,11,12. Метод относительно прост, удобен в использовании, и если основные параметры стандартизированы, он чувствителен и воспроизводим в различных сосудистых системах (например, артериях [сонных и бедренных], венах [яремных] и артериолах [кремастерных и брыжеечных]) (Дополнительная таблица 1).
Эта модель также может быть использована для дальнейшего понимания механики и морфологии образования сгустков. Этот метод однозначно предлагает преимущество остановки тромбоза в различных точках скорости потока, чтобы изучить промежуточные стадии процесса, прежде чем он станет окклюзионным. Последние достижения в исследованиях тромбоза использовали эту модель, чтобы сосредоточить внимание на нефармакологических методах тромболизиса13 или неинвазивной доставки антитромботических и/или фибринолитических агентов14,15. Несколько групп показали, что, когда мембраны тромбоцитов покрыты этими терапевтическими средствами, лекарства могут быть активированы при термической стимуляции для воздействия на сгустки16. Описанные здесь методы могут быть полезны для таких исследований, как подтверждение их результатов на уровне отдельных тромбоцитов. В этой рукописи Протокол 1 описывает базовую процедуру повреждения сосудов, опосредованную FeCl3, в то время как Протокол 2 описывает метод сбора и фиксации образца сосудистого повреждения для дальнейшего анализа с помощью электронной микроскопии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Местное применение FeCl3 в сосудистой сети для индукции тромбоза является широко используемым методом и играет важную роль в установлении ролей различных рецепторов тромбоцитов, сигнальных путей лиганда и их ингибиторов20,21,22,23<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят сотрудников Лаборатории Уайтхарта за внимательное прочтение этой рукописи. Работа была поддержана грантами от NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 и HL150818), а также премией Департамента по делам ветеранов за заслуги перед S.W.W., R01 HL 155519 B.S. и грантом очной программы NIBIB для R.D.L.
Materials
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1×2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Palta, S., Saroa, R., Palta, A. Overview of the coagulation system. Indian Journal of Anaesthesia. 58 (5), 515-523 (2014).
- Joshi, S., Whiteheart, S. W. The nuts and bolts of the platelet release reaction. Platelets. 28 (2), 129-137 (2017).
- Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis. International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).
- Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice. Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
- Denis, C. V., et al. Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).
- Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).
- Kato, Y., et al. Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig. European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).
- Huttinger, A. L., et al. Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury. Journal of Visualized Experiments. (139), e57981 (2018).
- Zhang, W., et al. Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets. Small. 18 (15), 2106252 (2022).
- Liu, B., et al. Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration. Small. , 2205260 (2022).
- Refaat, A., et al. Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis. Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).
- Li, S., et al. Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation. Small. 18 (51), 2203184 (2022).
- Subramaniam, S., Kanse, S. M. Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).
- Cocchiaro, J. L., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Valdivia, R. H. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (27), 9379-9384 (2008).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric-estimation from incomplete observations. Journal of the American Statistical Association. 53 (282), 457-481 (1958).
- Chauhan, A. K., Kisucka, J., Lamb, C. B., Bergmeier, W., Wagner, D. D. von Willebrand factor and factor VIII are independently required to form stable occlusive thrombi in injured veins. Blood. 109 (6), 2424-2429 (2007).
- Andre, P., et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin–dependent mechanism. Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).
- Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 385-392 (2000).
- Bergmeier, W., et al. The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16900-16905 (2006).
- Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126 (6), 817-824 (2015).
- Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).
- Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).
- Shim, Y., et al. Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration. Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).
- Ghosh, S., et al. Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models. PLoS One. 16 (10), 0258192 (2021).
- Wilbs, J., et al. Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs. Nature Communications. 11 (1), 3890 (2020).
- Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).
- Jacob-Ferreira, A. L., et al. Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).
- Zhou, X., et al. A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).
- Yang, X., et al. Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis. BioMed Research International. 2022, 4893859 (2022).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
- Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. Journal of Visualized Experiments. (115), e54479 (2016).
- Holly, S. P., et al. Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis. Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).
- Bird, J. E., et al. Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis. Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).
