Trombosis arterial inducida por cloruro férrico y recolección de muestras para análisis de microscopía electrónica 3D
Summary
El presente protocolo describe cómo utilizar una lesión mediada por FeCl3 para inducir trombosis arterial, y cómo recoger y preparar muestras de lesión arterial en diversas etapas de trombosis para el análisis de microscopía electrónica.
Abstract
Las enfermedades cardiovasculares son una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en todo el mundo. La trombosis aberrante es una característica común de afecciones sistémicas como la diabetes y la obesidad, y enfermedades inflamatorias crónicas como la aterosclerosis, el cáncer y las enfermedades autoinmunes. Tras una lesión vascular, generalmente el sistema de coagulación, las plaquetas y el endotelio actúan de manera orquestada para prevenir el sangrado formando un coágulo en el sitio de la lesión. Las anomalías en este proceso conducen a sangrado excesivo o trombosis incontrolada / actividad antitrombótica insuficiente, lo que se traduce en oclusión de los vasos y sus secuelas. El modelo de lesión carotídea inducida por FeCl3 es una herramienta valiosa para investigar cómo se inicia y progresa la trombosis in vivo. Este modelo implica daño endotelial/denudación y posterior formación de coágulos en el sitio lesionado. Proporciona un ensayo cuantitativo altamente sensible para monitorear el daño vascular y la formación de coágulos en respuesta a diferentes grados de daño vascular. Una vez optimizada, esta técnica estándar se puede utilizar para estudiar los mecanismos moleculares subyacentes a la trombosis, así como los cambios ultraestructurales en las plaquetas en un trombo en crecimiento. Este ensayo también es útil para estudiar la eficacia de los agentes antitrombóticos y antiplaquetarios. Este artículo explica cómo iniciar y monitorear la trombosis arterial inducida por FeCl3 y cómo recolectar muestras para su análisis por microscopía electrónica.
Introduction
La trombosis es la formación de un coágulo de sangre que bloquea parcial o completamente un vaso sanguíneo, impidiendo el flujo natural de la sangre. Esto conduce a eventos cardiovasculares graves y fatales, como cardiopatía isquémica y accidentes cerebrovasculares. Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de morbilidad y mortalidad, y causan una de cada cuatro muertes en todo el mundo 1,2,3. Aunque la trombosis se manifiesta como un mal funcionamiento del sistema vascular, podría ser el resultado de una infección microbiana o viral subyacente, un trastorno inmunitario, una neoplasia maligna o una afección metabólica. El flujo de sangre es mantenido por la compleja interacción entre diversos componentes del sistema vascular, incluyendo células endoteliales, glóbulos rojos/blancos, plaquetas y factores de coagulación4. Tras la lesión vascular, las plaquetas interactúan con proteínas adhesivas en la matriz subendotelial y liberan su contenido granular, que recluta más plaquetas5. Al mismo tiempo, la cascada de coagulación se activa, lo que lleva a la formación y deposición de fibrina. En última instancia, se forma un coágulo, que contiene plaquetas y glóbulos rojos atrapados dentro de una malla de fibrina6. Aunque hay fármacos antiplaquetarios y anticoagulantes disponibles para modular la trombosis, el sangrado espurio sigue siendo una preocupación importante con estas terapias, lo que requiere un ajuste fino de las dosis y combinaciones de estos fármacos. Por lo tanto, todavía hay una necesidad urgente de descubrir nuevos fármacos antitrombóticos7.
La trombosis se estudia utilizando múltiples métodos para infligir lesiones vasculares: mecánicas (ligadura de vasos), térmicas (lesión con láser) y químicas (aplicación de FeCl3 / Rosa de Bengala). La naturaleza de la trombosis varía según la ubicación (arterial vs. venosa), el método o la extensión de la lesión. Entre todos estos tipos, la lesión vascular inducida por FeCl3 es el método más utilizado. Se ha empleado en ratones, ratas, conejos, conejillos de indias y perros 8,9,10,11,12. El método es relativamente simple, fácil de usar y, si los parámetros principales están estandarizados, es sensible y reproducible en varios sistemas vasculares (por ejemplo, arterias [carótidas y femorales], venas [yugulares] y arteriolas [cremáster y mesentérica]) (Tabla suplementaria 1).
Este modelo también se puede utilizar para ampliar nuestra comprensión de la mecánica y la morfología de la formación de coágulos. Esta técnica ofrece la ventaja única de detener la trombosis en varios puntos de velocidad de flujo, para estudiar las etapas intermedias del proceso antes de que se vuelva oclusivo. Los avances recientes en la investigación de la trombosis han utilizado este modelo para centrar la atención en métodos no farmacológicos de trombólisis13 o administración no invasiva de agentes antitrombóticos y/o fibrinolíticos14,15. Varios grupos han demostrado que, cuando las membranas plaquetarias están recubiertas con estas terapias, los fármacos pueden activarse tras la estimulación térmica para atacar los coágulos16. Las técnicas descritas aquí pueden ser útiles para estudios tales como la validación de sus hallazgos a nivel de plaqueta única. En este manuscrito, el Protocolo 1 describe el procedimiento básico de lesión vascular mediada por FeCl3, mientras que el Protocolo 2 describe el método para recolectar y fijar la muestra de lesión vascular para su posterior análisis por microscopía electrónica.
Protocol
Representative Results
Discussion
La aplicación tópica de FeCl3 a la vasculatura para inducir trombosis es una técnica ampliamente utilizada, y ha sido fundamental para establecer roles para varios receptores plaquetarios, vías de señalización de ligandos y sus inhibidores20,21,22,23. El mecanismo a través del cual FeCl3 causa trombosis es multifacético; Anteriormente, la denudación endotelial era…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a los miembros del Laboratorio Whiteheart por su cuidadosa lectura de este manuscrito. El trabajo fue apoyado por subvenciones de los NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 y HL150818), y un Premio al Mérito del Departamento de Asuntos de Veteranos a S.W.W., R01 HL 155519 a B.S., y una subvención del programa intramuros NIBIB a R.D.L.
Materials
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1×2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
References
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