फेरिक क्लोराइड-प्रेरित धमनी घनास्त्रता और 3 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए नमूना संग्रह
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल बताता है कि धमनी घनास्त्रता को प्रेरित करने के लिए एफईसीएल3-मध्यस्थता चोट का उपयोग कैसे करें, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए घनास्त्रता के विभिन्न चरणों में धमनी चोट के नमूने कैसे एकत्र करें और तैयार करें।
Abstract
कार्डियोवैस्कुलर बीमारियां दुनिया भर में मृत्यु दर और रुग्णता का एक प्रमुख कारण हैं। असामान्य घनास्त्रता मधुमेह और मोटापे जैसी प्रणालीगत स्थितियों और एथेरोस्क्लेरोसिस, कैंसर और ऑटोइम्यून बीमारियों जैसी पुरानी सूजन संबंधी बीमारियों की एक सामान्य विशेषता है। संवहनी चोट पर, आमतौर पर जमावट प्रणाली, प्लेटलेट्स और एंडोथेलियम चोट की जगह पर थक्का बनाकर रक्तस्राव को रोकने के लिए एक व्यवस्थित तरीके से कार्य करते हैं। इस प्रक्रिया में असामान्यताएं या तो अत्यधिक रक्तस्राव या अनियंत्रित घनास्त्रता / अपर्याप्त एंटीथ्रॉम्बोटिक गतिविधि का कारण बनती हैं, जो पोत रोड़ा और इसकी अगली कड़ी में बदल जाती है। FeCl3-प्रेरित कैरोटिड चोट मॉडल यह जांचने में एक मूल्यवान उपकरण है कि विवो में घनास्त्रता कैसे शुरू होती है और प्रगति करती है। इस मॉडल में घायल स्थल पर एंडोथेलियल क्षति / विनाश और बाद में थक्का गठन शामिल है। यह संवहनी क्षति के विभिन्न डिग्री के जवाब में संवहनी क्षति और थक्के के गठन की निगरानी के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील, मात्रात्मक परख प्रदान करता है। एक बार अनुकूलित होने के बाद, इस मानक तकनीक का उपयोग थ्रोम्बोसिस के अंतर्निहित आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, साथ ही साथ बढ़ते थ्रोम्बस में प्लेटलेट्स में अल्ट्रास्ट्रक्चरल परिवर्तन भी होते हैं। यह परख एंटीथ्रोम्बोटिक और एंटीप्लेटलेट एजेंटों की प्रभावकारिता का अध्ययन करने के लिए भी उपयोगी है। यह लेख बताता है कि FeCl3-प्रेरित धमनी घनास्त्रता को कैसे शुरू और मॉनिटर किया जाए और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण के लिए नमूने कैसे एकत्र किए जाएं।
Introduction
थ्रोम्बोसिस एक रक्त के थक्के का गठन है जो आंशिक रूप से या पूरी तरह से रक्त वाहिका को अवरुद्ध करता है, रक्त के प्राकृतिक प्रवाह को बाधित करता है। यह गंभीर और घातक कार्डियोवैस्कुलर घटनाओं की ओर जाता है, जैसे कि इस्केमिक हृदय रोग और स्ट्रोक। कार्डियोवैस्कुलर बीमारियां रुग्णता और मृत्यु दर का प्रमुख कारण हैं, और दुनिया भर में चार मौतों में से एक का कारणबनती हैं। यद्यपि घनास्त्रता संवहनी प्रणाली की खराबी के रूप में प्रकट होती है, यह एक अंतर्निहित माइक्रोबियल या वायरल संक्रमण, प्रतिरक्षा विकार, घातकता या चयापचय स्थिति का परिणाम हो सकता है। एंडोथेलियल कोशिकाओं, लाल / सफेद रक्त कोशिकाओं, प्लेटलेट्स और जमावट कारकों सहित संवहनी प्रणाली के विभिन्न घटकों के बीच जटिल बातचीत द्वारा रक्त का प्रवाह बनाए रखाजाता है। संवहनी चोट पर, प्लेटलेट्स सबेंडोथेलियल मैट्रिक्स पर चिपकने वाले प्रोटीन के साथ बातचीत करते हैं और उनकी दानेदार सामग्री जारी करते हैं, जो अधिक प्लेटलेट्सकी भर्ती करते हैं। समवर्ती रूप से, जमावट कैस्केड सक्रिय होता है, जिससे फाइब्रिन का गठन और जमाव होता है। अंततः, एक थक्का बनता है, जिसमें प्लेटलेट्स और लाल रक्त कोशिकाएं होती हैं जो एक फाइब्रिन जाल 6 के भीतर फंसजाती हैं। यद्यपि एंटीप्लेटलेट और एंटीकोआगुलेंट दवाएं घनास्त्रता को संशोधित करने के लिए उपलब्ध हैं, नकली रक्तस्राव इन उपचारों के साथ एक प्रमुख चिंता का विषय बना हुआ है, जिसके लिए इन दवाओं की खुराक और संयोजन को ठीक करने की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, अभी भी नई एंटी-थ्रोम्बोटिक दवाओं की खोज करने की तत्काल आवश्यकताहै।
संवहनी चोट पहुंचाने के लिए कई तरीकों का उपयोग करके थ्रोम्बोसिस का अध्ययन किया जाता है: यांत्रिक (पोत बंधाव), थर्मल (लेजर चोट), और रासायनिक चोट (FeCl3 / Rose Bengal अनुप्रयोग)। घनास्त्रता की प्रकृति स्थान (धमनी बनाम शिरापरक), विधि, या चोट की सीमा के आधार पर भिन्न होती है। इन सभी प्रकारों में, FeCl3-प्रेरित संवहनी चोट सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है। यह चूहों, चूहों, खरगोशों, गिनी सूअरों और कुत्तों 8,9,10,11,12 में नियोजित किया गया है। विधि अपेक्षाकृत सरल है, उपयोग करने में आसान है, और यदि प्रमुख मापदंडों को मानकीकृत किया जाता है, तो यह विभिन्न संवहनी प्रणालियों (जैसे, धमनियों [कैरोटिड और ऊरु], नसों [जुगुलर], और धमनी [क्रेमास्टर और मेसेंटेरिक]) में संवेदनशील और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है (पूरक तालिका 1)।
इस मॉडल का उपयोग थक्का गठन के यांत्रिकी और आकृति विज्ञान की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए भी किया जा सकता है। यह तकनीक विशिष्ट रूप से विभिन्न प्रवाह दर बिंदुओं पर घनास्त्रता को रोकने का लाभ प्रदान करती है, ताकि प्रक्रिया के मध्यवर्ती चरणों का अध्ययन किया जा सके। थ्रोम्बोसिस अनुसंधान में हालिया प्रगति ने इस मॉडल का उपयोग थ्रोम्बोलिसिस13 के गैर-औषधीय तरीकों या एंटी-थ्रोम्बोटिक और / या फाइब्रिनोलिटिकएजेंटों के गैर-इनवेसिव वितरण पर ध्यान केंद्रित करने के लिए किया है। कई समूहों ने दिखाया है कि, जब प्लेटलेट झिल्ली को इन चिकित्सीय के साथ लेपित किया जाता है, तो थक्कों को लक्षित करने के लिए थर्मल उत्तेजना पर दवाओं को सक्रियकिया जा सकता है। यहां वर्णित तकनीकें एकल प्लेटलेट स्तर पर उनके निष्कर्षों के सत्यापन के रूप में ऐसे अध्ययनों के लिए उपयोगी हो सकती हैं। इस पांडुलिपि में, प्रोटोकॉल 1 मूल FeCl3-मध्यस्थता संवहनी चोट प्रक्रिया का वर्णन करता है, जबकि प्रोटोकॉल 2 इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा आगे के विश्लेषण के लिए संवहनी चोट के नमूने को एकत्र करने और ठीक करने की विधि का वर्णन करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
थ्रोम्बोसिस को प्रेरित करने के लिए वास्कुलचर के लिए FeCl3 का सामयिक अनुप्रयोग एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है, और विभिन्न प्लेटलेट रिसेप्टर्स, लिगैंड सिग्नलिंग मार्गों और उनके <s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस पांडुलिपि के सावधानीपूर्वक अवलोकन के लिए व्हाइटहार्ट प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनआईएच, एनएचएलबीआई (एचएल 56652, एचएल 138179, और एचएल 150818) से अनुदान और एसडब्ल्यूडब्ल्यू को वेटरन्स अफेयर्स मेरिट अवार्ड विभाग, बी.एस. को आर01 एचएल 155519, और आर.डी.एल. को एनआईबीआईबी इंट्राम्यूरल प्रोग्राम अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1×2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
References
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