Jernkloridindusert arteriell trombose og prøvetaking for 3D-elektronmikroskopianalyse
Summary
Denne protokollen beskriver hvordan man bruker en FeCl3-mediert skade for å indusere arteriell trombose, og hvordan man samler inn og forbereder arterielle skadeprøver på ulike stadier av trombose for elektronmikroskopianalyse.
Abstract
Hjerte- og karsykdommer er en ledende årsak til dødelighet og sykelighet over hele verden. Avvikende trombose er et vanlig trekk ved systemiske tilstander som diabetes og fedme, og kroniske inflammatoriske sykdommer som aterosklerose, kreft og autoimmune sykdommer. Ved vaskulær skade virker vanligvis koagulasjonssystemet, blodplater og endotel på en orkestrert måte for å forhindre blødning ved å danne en blodpropp på skadestedet. Abnormaliteter i denne prosessen fører til enten overdreven blødning eller ukontrollert trombose / utilstrekkelig antitrombotisk aktivitet, noe som oversettes til okklusjon av fartøyet og dets følgesykdommer. FeCl 3-indusert carotisskademodell er et verdifullt verktøy for å undersøke hvordan trombose initierer og utvikler seg in vivo. Denne modellen innebærer endotelskade/denudasjon og påfølgende koagulasjonsdannelse på skadestedet. Det gir en svært sensitiv, kvantitativ analyse for å overvåke vaskulær skade og koagulasjonsdannelse som respons på forskjellige grader av vaskulær skade. Når den er optimalisert, kan denne standardteknikken brukes til å studere de molekylære mekanismene som ligger til grunn for trombose, samt de ultrastrukturelle endringene i blodplater i en voksende trombus. Denne analysen er også nyttig for å studere effekten av antitrombotiske og platehemmende midler. Denne artikkelen forklarer hvordan man initierer og overvåker FeCl 3-indusert arteriell trombose og hvordan man samler prøver for analyse ved elektronmikroskopi.
Introduction
Trombose er dannelsen av en blodpropp som delvis eller helt blokkerer et blodkar, og hindrer blodets naturlige strømning. Dette fører til alvorlige og dødelige kardiovaskulære hendelser, som iskemisk hjertesykdom og slag. Hjerte- og karsykdommer er den viktigste årsaken til sykelighet og dødelighet, og forårsaker ett av fire dødsfall på verdensbasis 1,2,3. Selv om trombose manifesteres som en funksjonsfeil i det vaskulære systemet, kan det være et resultat av en underliggende mikrobiell eller virusinfeksjon, immunforstyrrelse, malignitet eller metabolsk tilstand. Blodstrømmen opprettholdes av det komplekse samspillet mellom ulike komponenter i det vaskulære systemet, inkludert endotelceller, røde / hvite blodlegemer, blodplater og koagulasjonsfaktorer4. Ved vaskulær skade interagerer blodplater med klebende proteiner på subendotelmatrisen og frigjør deres granulære innhold, som rekrutterer flere blodplater5. Samtidig aktiveres koagulasjonskaskaden, noe som fører til fibrindannelse og avsetning. Til slutt dannes en blodpropp som inneholder blodplater og røde blodlegemer fanget i et fibrinnett6. Selv om antiplatelet og antikoagulerende legemidler er tilgjengelige for å modulere trombose, er falsk blødning fortsatt et stort problem med disse terapiene, og krever finjustering av doser og kombinasjoner av disse legemidlene. Dermed er det fortsatt et presserende behov for å oppdage nye antitrombotiske legemidler7.
Trombose studeres ved hjelp av flere metoder for å forårsake vaskulær skade: mekanisk (fartøyligering), termisk (laserskade) og kjemisk skade (FeCl3 / Rose Bengal-applikasjon). Arten av trombose varierer avhengig av plasseringen (arteriell vs venøs), metode eller omfanget av skaden. Blant alle disse typene er FeCl 3-indusert vaskulær skade den mest brukte metoden. Det har vært brukt på mus, rotter, kaniner, marsvin og hunder 8,9,10,11,12. Metoden er relativt enkel, enkel å bruke, og hvis hovedparametrene er standardiserte, er den sensitiv og reproduserbar i forskjellige vaskulære systemer (f.eks. arterier [carotis og femoral], vener [jugular] og arterioler [cremaster og mesenteric]) (tilleggstabell 1).
Denne modellen kan også brukes til å fremme vår forståelse av mekanikken og morfologien til koagulasjonsdannelse. Denne teknikken gir unikt fordelen av å stoppe trombose ved forskjellige strømningshastighetspunkter, for å studere mellomstadiene av prosessen før den blir okklusiv. Nylige fremskritt innen tromboseforskning har brukt denne modellen til å fokusere oppmerksomheten på ikke-farmakologiske metoder for trombolyse13 eller ikke-invasiv levering av antitrombotiske og / eller fibrinolytiske midler14,15. Flere grupper har vist at når blodplatemembraner er belagt med disse terapiene, kan legemidlene aktiveres ved termisk stimulering for å målrette blodpropper16. Teknikkene beskrevet her kan være nyttige for slike studier som validering av funnene på enkelt blodplatenivå. I dette manuskriptet beskriver protokoll 1 den grunnleggende FeCl 3-medierte vaskulære skadeprosedyren, mens protokoll 2 beskriver metoden for innsamling og fiksering av vaskulær skadeprøve for videre analyse ved elektronmikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den topiske anvendelsen av FeCl3 til vaskulaturen for å indusere trombose er en mye brukt teknikk, og har vært medvirkende til å etablere roller for forskjellige blodplatereseptorer, ligandsignalveier og deres hemmere20,21,22,23. Mekanismen gjennom hvilken FeCl3 forårsaker trombose er mangesidig; Tidligere ble endotelial denudasjon ansett som en årsak til trombose, me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker medlemmene av Whiteheart Laboratory for deres grundige gjennomlesning av dette manuskriptet. Arbeidet ble støttet av tilskudd fra NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 og HL150818), og en Department of Veterans Affairs Merit Award til S.W.W., R01 HL 155519 til BS, og NIBIB intramural program grant til RDL.
Materials
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1×2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Palta, S., Saroa, R., Palta, A. Overview of the coagulation system. Indian Journal of Anaesthesia. 58 (5), 515-523 (2014).
- Joshi, S., Whiteheart, S. W. The nuts and bolts of the platelet release reaction. Platelets. 28 (2), 129-137 (2017).
- Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis. International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).
- Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice. Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
- Denis, C. V., et al. Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).
- Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).
- Kato, Y., et al. Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig. European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).
- Huttinger, A. L., et al. Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury. Journal of Visualized Experiments. (139), e57981 (2018).
- Zhang, W., et al. Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets. Small. 18 (15), 2106252 (2022).
- Liu, B., et al. Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration. Small. , 2205260 (2022).
- Refaat, A., et al. Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis. Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).
- Li, S., et al. Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation. Small. 18 (51), 2203184 (2022).
- Subramaniam, S., Kanse, S. M. Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).
- Cocchiaro, J. L., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Valdivia, R. H. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (27), 9379-9384 (2008).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric-estimation from incomplete observations. Journal of the American Statistical Association. 53 (282), 457-481 (1958).
- Chauhan, A. K., Kisucka, J., Lamb, C. B., Bergmeier, W., Wagner, D. D. von Willebrand factor and factor VIII are independently required to form stable occlusive thrombi in injured veins. Blood. 109 (6), 2424-2429 (2007).
- Andre, P., et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin–dependent mechanism. Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).
- Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 385-392 (2000).
- Bergmeier, W., et al. The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16900-16905 (2006).
- Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126 (6), 817-824 (2015).
- Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).
- Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).
- Shim, Y., et al. Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration. Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).
- Ghosh, S., et al. Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models. PLoS One. 16 (10), 0258192 (2021).
- Wilbs, J., et al. Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs. Nature Communications. 11 (1), 3890 (2020).
- Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).
- Jacob-Ferreira, A. L., et al. Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).
- Zhou, X., et al. A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).
- Yang, X., et al. Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis. BioMed Research International. 2022, 4893859 (2022).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
- Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. Journal of Visualized Experiments. (115), e54479 (2016).
- Holly, S. P., et al. Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis. Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).
- Bird, J. E., et al. Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis. Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).
