Järnkloridinducerad arteriell trombos och provinsamling för 3D-elektronmikroskopianalys
Summary
Detta protokoll beskriver hur man använder en FeCl3-medierad skada för att inducera arteriell trombos och hur man samlar in och förbereder arteriella skadeprover vid olika stadier av trombos för elektronmikroskopianalys.
Abstract
Hjärt- och kärlsjukdomar är en ledande orsak till dödlighet och sjuklighet över hela världen. Avvikande trombos är ett vanligt inslag i systemiska tillstånd som diabetes och fetma och kroniska inflammatoriska sjukdomar som åderförkalkning, cancer och autoimmuna sjukdomar. Vid vaskulär skada verkar vanligtvis koagulationssystemet, blodplättar och endotel på ett orkestrerat sätt för att förhindra blödning genom att bilda en blodpropp på skadan. Avvikelser i denna process leder till antingen kraftig blödning eller okontrollerad trombos/otillräcklig antitrombotisk aktivitet, vilket leder till kvarocklusion och dess följder. FeCl3-inducerad karotisskademodell är ett värdefullt verktyg för att undersöka hur trombos initieras och fortskrider in vivo. Denna modell innefattar endotelskada / denudation och efterföljande koagulationsbildning på den skadade platsen. Det ger en mycket känslig, kvantitativ analys för att övervaka vaskulär skada och koagulationsbildning som svar på olika grader av vaskulär skada. När den har optimerats kan denna standardteknik användas för att studera de molekylära mekanismerna bakom trombos, liksom de ultrastrukturella förändringarna i blodplättar i en växande trombos. Denna analys är också användbar för att studera effekten av antitrombotiska och trombocythämmande medel. Denna artikel förklarar hur man initierar och övervakar FeCl3-inducerad arteriell trombos och hur man samlar in prover för analys med elektronmikroskopi.
Introduction
Trombos är bildandet av en blodpropp som helt eller delvis blockerar ett blodkärl, vilket hindrar blodets naturliga flöde. Detta leder till allvarliga och dödliga kardiovaskulära händelser, såsom ischemisk hjärtsjukdom och stroke. Hjärt-kärlsjukdomar är den främsta orsaken till sjuklighet och dödlighet och orsakar en av fyra dödsfall i världen 1,2,3. Även om trombos manifesteras som ett fel i kärlsystemet kan det vara ett resultat av en underliggande mikrobiell eller virusinfektion, immunsjukdom, malignitet eller metaboliskt tillstånd. Blodflödet upprätthålls av den komplexa interaktionen mellan olika komponenter i kärlsystemet, inklusive endotelceller, röda / vita blodkroppar, blodplättar och koagulationsfaktorer4. Vid vaskulär skada interagerar blodplättar med adhesiva proteiner på subendotelmatrisen och frigör deras granulära innehåll, vilket rekryterar fler blodplättar5. Samtidigt aktiveras koagulationskaskaden, vilket leder till fibrinbildning och avsättning. I slutändan bildas en blodpropp som innehåller blodplättar och röda blodkroppar fångade i ett fibrinnät6. Även om trombocythämmande och antikoagulantia läkemedel finns tillgängliga för att modulera trombos, är falsk blödning fortfarande ett stort problem med dessa terapier, vilket kräver finjustering av doserna och kombinationerna av dessa läkemedel. Således finns det fortfarande ett brådskande behov av att upptäcka nya antitrombotiska läkemedel7.
Trombos studeras med flera metoder för att orsaka vaskulär skada: mekanisk (kärlligering), termisk (laserskada) och kemisk skada (FeCl3 / Rose Bengal applikation). Trombosens art varierar beroende på platsen (arteriell kontra venös), metod eller skadans omfattning. Bland alla dessa typer är FeCl3-inducerad vaskulär skada den mest använda metoden. Det har använts på möss, råttor, kaniner, marsvin och hundar 8,9,10,11,12. Metoden är relativt enkel, lätt att använda, och om viktiga parametrar standardiseras är den känslig och reproducerbar i olika kärlsystem (t.ex. artärer [halspulsåder och lårben], vener [jugulära] och arterioler [cremaster och mesenteric]) (kompletterande tabell 1).
Denna modell kan också användas för att öka vår förståelse av mekaniken och morfologin för koagulationsbildning. Denna teknik erbjuder unikt fördelen att stoppa trombos vid olika flödeshastighetspunkter, för att studera de mellanliggande stadierna i processen innan den blir ocklusiv. Nya framsteg inom trombosforskning har använt denna modell för att fokusera uppmärksamheten på icke-farmakologiska metoder för trombolys13 eller icke-invasiv leverans av antitrombotiska och / eller fibrinolytiska medel14,15. Flera grupper har visat att när trombocytmembran är belagda med dessa terapier kan läkemedlen aktiveras vid termisk stimulering för att rikta blodproppar16. De tekniker som beskrivs här kan vara användbara för sådana studier som validering av deras resultat på enkel trombocytnivå. I detta manuskript beskriver protokoll 1 den grundläggande FeCl3-medierade vaskulära skadeproceduren, medan protokoll 2 beskriver metoden för att samla in och fixera kärlskadeprovet för vidare analys med elektronmikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den topiska appliceringen av FeCl3 på vaskulaturen för att inducera trombos är en allmänt använd teknik och har varit avgörande för att etablera roller för olika trombocytreceptorer, ligandsignalvägar och deras hämmare20,21,22,23. Mekanismen genom vilken FeCl3 orsakar trombos är mångfacetterad; Tidigare ansågs endoteldenudation vara en orsak till trombos, men …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar medlemmarna i Whiteheart Laboratory för deras noggranna granskning av detta manuskript. Arbetet stöddes av bidrag från NIH, NHLBI (HL56652, HL138179 och HL150818) och ett Department of Veterans Affairs Merit Award till S.W.W., R01 HL 155519 till BS och NIBIB intramuralt programbidrag till R.D.L.
Materials
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | NaCl used to make a solution of 0.9% saline |
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309659 | |
| 190 Proof Ethanol | KOPTEC | V1101 | Used to make a 70% ethanol solution to use for prepping the mouse for surgery |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 Yard Black Braided Silk Suture (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 Needle | Becton, Dickinson and Company | 305110 | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL Transfer Pipet, Graduated to 3 mL | Globe Scientific Inc. | 135010 | |
| Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol) | Medline | MDS090735 | |
| Araldite GY 502 | Electron microscopy Services | 10900 | |
| Cell Culture Dish 35mm X 10mm | Corning Incorporated | 430165 | |
| Compact Scale | Ward's Science | 470314-390 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm long | World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30 activator | Electron microscopy Services | 13600 | |
| Dodenyl Succinic Anhydride/ DDSA | Electron microscopy Services | 13700 | |
| Doggy Poo Bags/animal carcass disposal bag | Crown Products | PP-RB-200 | |
| Doppler FlowProbe | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812 resin | Electron microscopy Services | 14900 | |
| Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof | Electron microscopy Services | 15055 | |
| Eye Dressing Forceps, 4" Full Curved, Standard, 0.8mm Wide Tips | Integra Miltex | 18-784 | |
| Filter Paper | VWR | 28310-106 | |
| Fine Scissors – Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14028-10 | |
| Finger Loop Ear Punches | Fine Science Tools | 24212-01 | |
| Gauze Sponges 2” x 2” – 12 Ply | Dukal Corporation | 2128 | |
| Glutaraldehyde (10% solution) | Electron microscopy Services | 16120 | |
| Integra Miltex Carbon Steel Surgical Blade #10 | Integra® Miltex® | 4110 | |
| Iron (III) Chloride | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| Knife Handle Miltex® Extra Fine Stainless Steel Size 3 | Integra Lifesciences | 157510 | |
| L-aspartic acid | Sigma Fisher | A93100 | |
| L-aspartic acid | Fisher Scientific | BP374-100 | |
| Lead Nitrate | Fisher Scientific | L-62 | |
| LEICA S8AP0 Microscope | LEICA | No longer available | No longer available from the company |
| LEICA S8AP0 Microscope Stand | LEICA | 10447255 | No longer available from the company |
| Light-Duty Tissue Wipers | VWR | 82003-822 | |
| Micro Dissecting Forceps; 1×2 Teeth, Full Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| Osmium Tetroxide 4% aqueous solution | Electron microscopy Services | 19150 | |
| Paraformaldehyde (16% solution) | Electron microscopy Services | 15710 | |
| Potassium ferricyanide | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| Propylene Oxide, ACS reagent | Electron microscopy Services | 20401 | |
| Rainin Classic Pipette PR-10 | Rainin | 17008649 | |
| Research Flowmeter | Transonic Systems Inc. | T402B01481 | Model: T402 |
| Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear | Scotch | 305289 | |
| Small Animal Heated Pad | K&H Manufacturing Inc. | Model: HM10 | |
| Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH7.4 | Electron microscopy Services | 11623 | |
| Sterile Cotton Tipped Applicators | Puritan Medical Products | 25-806 1WC | |
| Steromaster Illuminator | Fisher Scientific | 12-562-21 | No longer available from the company |
| Surgical Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Thiocarbohydrazide (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| Universal Low Retention Pipet Tip Reloads (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| Uranyl Acetate | Electron microscopy Services | 22400 | |
| Veet Gel Cream Hair Remover | Reckitt Benckiser | 3116875 | |
| White Antistatic Hexagonal Weigh Boats, Medium, 64 x 15 x 19 mm | Fisher Scientific | S38975 | |
| WinDAQ/100 Software for Windows | DATAQ Instruments, Inc. | Version 3.38 | Freely available to download. https://www.dataq.com/products/windaq/ |
| ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
References
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).
- Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
- Palta, S., Saroa, R., Palta, A. Overview of the coagulation system. Indian Journal of Anaesthesia. 58 (5), 515-523 (2014).
- Joshi, S., Whiteheart, S. W. The nuts and bolts of the platelet release reaction. Platelets. 28 (2), 129-137 (2017).
- Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis. International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).
- Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice. Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).
- Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
- Denis, C. V., et al. Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).
- Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).
- Kato, Y., et al. Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig. European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).
- Huttinger, A. L., et al. Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury. Journal of Visualized Experiments. (139), e57981 (2018).
- Zhang, W., et al. Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets. Small. 18 (15), 2106252 (2022).
- Liu, B., et al. Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration. Small. , 2205260 (2022).
- Refaat, A., et al. Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis. Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).
- Li, S., et al. Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation. Small. 18 (51), 2203184 (2022).
- Subramaniam, S., Kanse, S. M. Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).
- Cocchiaro, J. L., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Valdivia, R. H. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (27), 9379-9384 (2008).
- Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric-estimation from incomplete observations. Journal of the American Statistical Association. 53 (282), 457-481 (1958).
- Chauhan, A. K., Kisucka, J., Lamb, C. B., Bergmeier, W., Wagner, D. D. von Willebrand factor and factor VIII are independently required to form stable occlusive thrombi in injured veins. Blood. 109 (6), 2424-2429 (2007).
- Andre, P., et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin–dependent mechanism. Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).
- Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 385-392 (2000).
- Bergmeier, W., et al. The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16900-16905 (2006).
- Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126 (6), 817-824 (2015).
- Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).
- Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).
- Shim, Y., et al. Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration. Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).
- Ghosh, S., et al. Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models. PLoS One. 16 (10), 0258192 (2021).
- Wilbs, J., et al. Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs. Nature Communications. 11 (1), 3890 (2020).
- Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).
- Jacob-Ferreira, A. L., et al. Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).
- Zhou, X., et al. A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).
- Yang, X., et al. Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis. BioMed Research International. 2022, 4893859 (2022).
- Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
- Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. Journal of Visualized Experiments. (115), e54479 (2016).
- Holly, S. P., et al. Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis. Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).
- Bird, J. E., et al. Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis. Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).
