Antistofoptagelsesanalyse til sporing af hak/delta-endocytose under den asymmetriske opdeling af zebrafiskens radiale glia-forfædre

Summary

Dette arbejde udvikler et antistofoptagelsesassay til billeddannelse af intra-afstamning Notch/DeltaD-signalering ved opdeling af radiale glia-forfædre til den embryonale zebrafiskhjerne.

Abstract

Asymmetrisk celledeling (ACD), som producerer to datterceller af forskellige skæbner, er grundlæggende for at generere cellulær mangfoldighed. I de udviklende organer hos både hvirvelløse dyr og hvirveldyr genererer asymmetrisk delende forfædre et hak^hej selvfornyende og et hak^til differentierende datter. I den embryonale zebrafiskhjerne gennemgår radiale glia-forfædre (RGP’er) – de vigtigste neurale stamceller fra hvirveldyr – for det meste ACD for at føde en RGP og en differentierende neuron. Den optiske klarhed og nemme tilgængelighed af zebrafiskembryoner gør dem ideelle til in vivo time-lapse-billeddannelse til direkte visualisering af, hvordan og hvornår asymmetrien af Notch-signalering etableres under ACD. Nylige undersøgelser har vist, at dynamisk endocytose af Notch ligand DeltaD spiller en afgørende rolle i bestemmelse af celleskæbne under ACD, og processen reguleres af den evolutionært bevarede polaritetsregulator Par-3 (også kendt som Pard3) og dyneinmotorkomplekset. For at visualisere in vivo-handelsmønstrene for Notch-signalendosomer i mitotiske RGP’er har vi udviklet denne antistofoptagelsesanalyse. Ved hjælp af analysen har vi afdækket dynamikken i DeltaD-holdige endosomer under RGP-division.

Introduction

Notch-signalering styrer celleskæbnebeslutning og mønster under udvikling i metazoer¹, og nylige undersøgelser har vist, at Notch-signalering i stamcelledeling hovedsageligt afhænger af endocytisk handel ^2,3. Endocytosed Notch / Delta kan aktivere Notch-signalering i kernen og forbedre transkriptionen af Notch-målgener ^4,5,6. Retningsbestemt hak / Delta endosomal handel blev først observeret i Drosophila sensoriske organforløberceller (SOP) under dets asymmetriske celledeling (ACD), hvilket resulterede i en højere Notch-signalaktivitet i pIIa end i pIIb ^7,8. Antistofoptagelsesassays med anti-Delta og anti-Notch antistoffer er blevet anvendt til at overvåge den endocytiske proces i mitotiske SOP-celler. Notch/DeltaD-endosomer bevæger sig sammen med et kinesinmotorprotein til den centrale spindel under cytokinese og translokeres asymmetrisk ind i pIIa-cellen på grund af det antiparallelle array af den asymmetriske centrale spindel i sidste øjeblik af celledeling ^3,8. Disse undersøgelser har kastet lys over de molekylære mekanismer, der regulerer asymmetrisk opdeling i Drosophila SOP-celler, men det er uklart, om lignende endocytiske processer forekommer i vertebrat radiale glia-forfædre (RGP’er).

Desuden er de molekylære mekanismer, der regulerer asymmetrisk Notch / DeltaD-signalering under hvirveldyrs RGP-deling, ikke godt forstået. I zebrafisk er det blevet rapporteret, at interaktionen mellem Notch og Delta letter endocytose af DeltaD-liganden⁹. Det vides ikke, om DeltaD-endocytose kan påvirke celleskæbnevalget af datterceller i den udviklende hvirveldyrhjerne. Nylige undersøgelser viser, at injektion af fluorescerende konjugerede anti-DeltaD-antistoffer i neuralrøret kunne mærke Sara-endosomer specifikt i neuroepitelceller, og anti-DeltaD indeholdende Sara-endosomer adskilles fortrinsvis i prolifererende datterceller¹⁰. Det er blevet foreslået, at Notch-signalering fra endosomerne kunne regulere dattercelleskæbnen. Tidligere resultater har vist, at de fleste zebrafisk RGP-celler i den udviklende forhjerne gennemgår ACD, og dattercellens skæbnebestemmelse er afhængig af intralineage Notch/DeltaD signalering¹¹. For at belyse karakteren af intralineage Notch/DeltaD signaleringen i zebrafisk RGP’er, har vi udviklet anti-DeltaD antistof uptake assay i zebrafiskens udviklende hjerne. Ved hjælp af denne protokol har vi med succes udført live mærkning og billeddannelse af DeltaD endocytisk handel med mitotiske RGP’er.

Det fluorescerende mærkede anti-DeltaD-antistof internaliseres effektivt i RGP’erne langs forhjernens ventrikel. Det har i høj grad lettet opdagelsen af retningsbestemt handel med DeltaD-endosomer i de asymmetrisk opdelte RGP’er^12,13. Sammenlignet med tidligere antistofoptagelsesprotokoller udviklet til Drosophila notumkulturer og zebrafiskens rygmarv 10, har denne protokol opnået langvarig og yderst effektiv anti-DeltaD-mærkning i hjernens ventrikelcellelag, specifikt med mindre end¹⁰ nL mikroinjiceret antistofblanding. Injektionen af baghjernens ventrikel er meget praktisk til anvendelse af antistofoptagelsesanalysen i den udviklende hjerne, da baghjernens ventrikel er godt udvidet i zebrafiskembryoner og fyldt op med cerebrospinalvæske i det tidlige udviklingsstadium¹⁴. Ved at injicere antistofblandingen i baghjernens ventrikel uden at skade afgørende udviklende væv, har protokollen minimeret mulig skade på billeddannelseszonen i forhjernen så meget som muligt. Den reducerede dosis af det injicerede primære antistof har også undgået potentielle bivirkninger ved at forstyrre endogen Delta-Notch-signalering in vivo. Denne protokol kan let kombineres med andre farmakologiske eller genetiske forstyrrelser, der anvendes på forskellige udviklingsstadier og muligvis tilpasses den voksne hjerne såvel som humane pluripotente stamcelleafledte 2D / 3D hjerneorganoider. Samlet set har protokollen gjort det muligt at forstå, hvordan og hvornår Notch-signalasymmetri etableres under ACD. Den største udfordring for en vellykket gennemførelse af denne protokol er at opnå præcis levering af passende koncentrationer af antistoffet baseret på specifikke eksperimentelle betingelser.

Protocol

Vi har brugt AB wild type line og transgene line Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] til undersøgelsen. Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of California, San Francisco, USA (godkendelsesnummer: AN179000). 1. Forberedelse af zebrafiskembryoner Opsæt fiskekrydsningstanke om eftermiddagen før kl. 17.00 med en kvindelig vildtypefisk og en mandlig Tg [ef1a: Myr-Tdtomato] fisk ved hjælp af skillevæ…

Representative Results

I figur 2A viste embryonerne injiceret med Atto647N, uden binding med det primære antistof, baggrundsfluorescens i hjernens ventrikel. Meget få opslugte fluorescerende partikler kan observeres i cellerne. De anti-Dld-Atto647N injicerede zebrafiskembryoner viste store mængder internaliserede fluorescerende partikler i de fleste celler i den udviklende forhjerne (figur 2A, højre panel). Efter at have zoomet ind for at fokusere på mitotiske RGP’er, som vist i …

Discussion

Vi har udviklet et antistofoptagelsesassay til mærkning og billeddannelse af endosomal Notch/Delta handel med zebrafisk radiale glia-forfædre med høj effektivitet. Sammenlignet med tidligere metoder, der blev brugt til sporing af mærket anti-DeltaD-antistof i Drosophila SOP-celler^7,8, brugte vores metode mikroinjektion i stedet for inkubation af prøver i det konjugerede antistof. Fluorescerende konjugerede anti-DLD-antistoffer blev mikroinjiceret i baghjerne…

Materials

35mm glass bottom culture dish	MatTek corporation	P35GC-1.5-10-C
air pressure injector	Narishige	IM300
Anti-Mouse-IgG-Atto647N	Sigma-Aldrich	50185
CaCl2.2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament	World Precision Instruments	1B120F-6
CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield	Nikin	N/A	Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal.
Dumont Medical Tweezers Style 5	Thomas Scientific	72877-D
Flaming-Brown P897 puller	Sutter Instruments	N/A	https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf
KCl	Millipore	529552
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	M2773
micromanipulators	World Precision Instruments	WPI M3301R
Mouse anti-Dld	Abcam	AB_1268496
Mouse IgG blocking buffer from Zenon	Thermofisher Scientific	Z25008
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
Phenol red	Sigma-Aldrich	P0290
Stemi 2000	Zeiss	N/A
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
UltraPureTM low melting point agarose	Invitrogen	16520050