Ensayo de captación de anticuerpos para el seguimiento de la endocitosis notch/delta durante la división asimétrica de los progenitores radiales de la glía del pez cebra
Summary
Este trabajo desarrolla un ensayo de captación de anticuerpos para obtener imágenes de la señalización de Notch / DeltaD intra-linaje en la división de progenitores de glía radial del cerebro embrionario del pez cebra.
Abstract
La división celular asimétrica (ACD), que produce dos células hijas de diferentes destinos, es fundamental para generar diversidad celular. En los órganos en desarrollo tanto de invertebrados como de vertebrados, la división asimétrica de progenitores genera una Notchhi auto-renovadora y una hija Notchlo diferenciadora. En el cerebro embrionario del pez cebra, los progenitores de la glía radial (RGP), las principales células madre neurales de vertebrados, se someten principalmente a ACD para dar a luz a un RGP y una neurona diferenciadora. La claridad óptica y la fácil accesibilidad de los embriones de pez cebra los hacen ideales para obtener imágenes de lapso de tiempo in vivo para visualizar directamente cómo y cuándo se establece la asimetría de la señalización Notch durante ACD. Estudios recientes han demostrado que la endocitosis dinámica del ligando Notch DeltaD juega un papel crucial en la determinación del destino celular durante la ACD, y el proceso está regulado por el regulador de polaridad conservado evolutivamente Par-3 (también conocido como Pard3) y el complejo motor de dineína. Para visualizar los patrones de tráfico in vivo de los endosomas de señalización de Notch en los RGP mitóticos, hemos desarrollado este ensayo de captación de anticuerpos. Usando el ensayo, hemos descubierto el dinamismo de los endosomas que contienen DeltaD durante la división RGP.
Introduction
La señalización de Notch controla la decisión y el patrón del destino celular durante el desarrollo en metazoos1, y estudios recientes han demostrado que la señalización de Notch en la división de células madre depende principalmente del tráfico endocítico 2,3. Endocytosed Notch/Delta puede activar la señalización de Notch en el núcleo y mejorar la transcripción de los genes diana de Notch 4,5,6. El tráfico endosomal direccional Notch/Delta se observó por primera vez en células precursoras de órganos sensoriales (SOP) de Drosophila durante su división celular asimétrica (ACD), lo que resultó en una mayor actividad de señalización de Notch en pIIa que en pIIb 7,8. Se han aplicado ensayos de captación de anticuerpos con anticuerpos anti-Delta y anti-Notch para monitorizar el proceso endocítico en células POE mitóticas. Los endosomas Notch/DeltaD se mueven junto con una proteína motora de quinesina al huso central durante la citocinesis, y se translocan asimétricamente en la célula pIIa debido a la matriz antiparalela del huso central asimétrico en el último momento de la división celular 3,8. Estos estudios han arrojado luz sobre los mecanismos moleculares que regulan la división asimétrica en las células SOP de Drosophila, pero no está claro si ocurren procesos endocíticos similares en progenitores de glía radial de vertebrados (RGP).
Además, los mecanismos moleculares que regulan la señalización asimétrica de Notch/DeltaD durante la división RGP de vertebrados no se conocen bien. En el pez cebra, se ha descrito que la interacción de Notch y Delta facilita la endocitosis del ligando DeltaD9. Se desconoce si la endocitosis DeltaD puede afectar la elección del destino celular de las células hijas en el cerebro de los vertebrados en desarrollo. Estudios recientes muestran que la inyección de anticuerpos anti-DeltaD conjugados fluorescentes en el tubo neural podría marcar los endosomas Sara específicamente en las células neuroepiteliales, y los endosomas Sara que contienen anti-DeltaD se segregan preferentemente en células hijas proliferantes10. Se ha sugerido que la señalización de Notch de los endosomas podría regular el destino de las células hijas. Resultados anteriores han demostrado que la mayoría de las células RGP de pez cebra en el cerebro anterior en desarrollo experimentan ACD, y la determinación del destino de las células hijas depende de la señalización intralinaje Notch / DeltaD11. Con el fin de dilucidar la naturaleza de la señalización intralinaje Notch / DeltaD en RGP de pez cebra, hemos desarrollado el ensayo de captación de anticuerpos anti-DeltaD en el cerebro en desarrollo del pez cebra. Usando este protocolo, hemos realizado con éxito el etiquetado en vivo y las imágenes del tráfico endocítico DeltaD en RGP mitóticos.
El anticuerpo anti-DeltaD marcado con fluorescencia se internaliza eficientemente en los RGP a lo largo del ventrículo del cerebro anterior. Ha facilitado enormemente el descubrimiento del tráfico direccional de endosomas DeltaD en los RGPs de división asimétrica12,13. En comparación con los protocolos anteriores de captación de anticuerpos desarrollados para cultivos de Drosophila notum y la médula espinal del pez cebra 10, este protocolo ha logrado un marcado anti-DeltaD duradero y altamente eficiente en la capa de células del ventrículo cerebral, específicamente con menos de10 nL de mezcla de anticuerpos microinyectados. La inyección del ventrículo del cerebro posterior es muy conveniente para aplicar el ensayo de captación de anticuerpos en el cerebro en desarrollo, ya que el ventrículo del cerebro posterior está bien expandido en embriones de pez cebra y lleno de líquido cefalorraquídeo en la etapa temprana de desarrollo14. Al inyectar la mezcla de anticuerpos en el ventrículo del cerebro posterior sin dañar ningún tejido en desarrollo crucial, el protocolo ha minimizado el posible daño a la zona de imágenes en el cerebro anterior tanto como sea posible. La dosis reducida del anticuerpo primario inyectado también ha evitado los posibles efectos secundarios de interferir con la señalización endógena de Delta-Notch in vivo. Este protocolo puede combinarse fácilmente con otras perturbaciones farmacológicas o genéticas, utilizarse en diferentes etapas de desarrollo y posiblemente adaptarse al cerebro adulto, así como a los organoides cerebrales 2D / 3D derivados de células madre pluripotentes humanas. En conjunto, el protocolo ha permitido comprender cómo y cuándo se establece la asimetría de señalización Notch durante ACD. El principal desafío para la implementación exitosa de este protocolo es lograr la entrega precisa de concentraciones apropiadas del anticuerpo basadas en condiciones experimentales específicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos desarrollado un ensayo de captación de anticuerpos para el etiquetado y la obtención de imágenes del tráfico endosomal de Notch/Delta en progenitores radiales de la glía del pez cebra con alta eficiencia. En comparación con los métodos anteriores utilizados para rastrear anticuerpos anti-DeltaD marcados en células SOP de Drosophila 7,8, nuestro método utilizó microinyección en lugar de incubaciónde muestras en el anticuerpo conjugado. Se microin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El proyecto fue apoyado por NIH R01NS120218, el Premio Mary Anne Koda-Kimble Seed a la Innovación de la UCSF y Chan Zuckerberg Biohub.
Materials
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| air pressure injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Capillaries, 1.2 mm OD, 0.9 mm ID, with filament | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti inverted fluorescence microscope with CSU-W1 large field of view confocal. |
| Dumont Medical Tweezers Style 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Mouse anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Mouse IgG blocking buffer from Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM low melting point agarose | Invitrogen | 16520050 |
References
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