Summary
我们提出了一种灵活的化学和多模式刺激和记录许多 秀丽隐杆线虫 同时神经活动的方法。该方法使用微流体、开源硬件和软件以及有监督的自动数据分析来测量神经元现象，例如适应、时间抑制和刺激串扰。
Abstract
荧光基因编码的钙指示剂极大地促进了我们对神经动力学的理解，从单个神经元的水平到整个大脑回路。然而，神经反应可能因先前的经验、内部状态或随机因素而异，因此需要能够同时评估多个个体神经功能的方法。虽然大多数记录技术一次检查一只动物，但我们描述了使用宽场显微镜将神经元记录放大到数十种 秀丽隐杆线虫 或其他亚毫米级生物。开源硬件和软件在编程全自动实验方面具有极大的灵活性，这些实验控制各种刺激类型的强度和时间，包括化学、光学、机械、热和电磁刺激。特别是，微流体流动装置以亚秒级时间分辨率提供化学感觉刺激的精确、可重复和定量控制。然后，NeuroTracker半自动数据分析管道提取个体和人群范围的神经反应，以揭示神经兴奋性和动力学的功能变化。本文介绍了测量神经元适应、时间抑制和刺激串扰的示例。这些技术提高了刺激的精度和可重复性，允许探索群体变异性，并且可以推广到小型生物系统中从细胞和类器官到整个生物体和植物的其他动态荧光信号。
Introduction
钙成像技术允许使用荧光显微镜和靶细胞中表达的遗传编码钙指示剂实时无创记录体内神经动力学1，2，3。这些传感器通常使用绿色荧光蛋白（GFP），例如GFP-钙调蛋白-M13肽（GCaMP）家族，以增加神经元激活时的荧光强度和细胞内钙水平升高。钙成像在线虫秀丽隐杆线虫中特别强大，用于检查神经元和神经回路在活的，行为动物中的功能4，5，6，7，8，9，10，因为它们的透明性质意味着光学访问不需要手术过程，并且细胞特异性基因启动子将表达靶向感兴趣的细胞。这些技术通常利用微流体装置，其提供精确控制的环境，以在小物理尺度上研究生物，化学和物理现象11，12。用于测量神经活动的微流体装置比比皆是，新设计正在不断开发中，并且它们很容易在研究实验室中制造。然而，许多设计一次捕获一只动物，限制了实验吞吐量7，9，13。由于先前经验的差异，压力或饥饿等内部状态或基因表达水平等随机因素，动物的神经反应通常差异很大。这些差异确立了对能够同时刺激和观察许多动物并从个体中提取信息的方法的需求4.
此外，某些神经调节现象仅在特定的刺激条件下变得明显，例如时间抑制14，它指的是当刺激快速连续发生时对反应的短暂抑制。为此，电生理系统可以在广阔的刺激空间中驱动神经活动，例如，调节电脉冲电流、电压、频率、波形、占空比和周期性刺激序列的时间。自然检测到的刺激或光遗传学系统的间接刺激将受益于类似的控制机制。目前，许多自然刺激以简单的“开关”方式呈现，例如气味呈现和去除，使用商业系统在增加灵活性方面进展缓慢。然而，廉价的微控制器现在可以根据研究人员的需求定制的方式自动传递几种类型的刺激。结合微流体，这些系统已经实现了提高实验通量和灵活性的目标，允许在许多动物中同时测量对各种精确刺激的神经反应4，6。多模态刺激可用于进一步询问神经元回路，例如在正交扰动（如药物暴露）之前、期间和之后持续刺激时监测神经兴奋性的变化4。廉价、开放的显微镜系统对于推进科学研究的好处是显而易见的，但在实践中，对零件采购、构造和性能验证的需求可能会阻碍这些技术的采用。
该协议旨在缓解其中一些技术挑战。虽然以前的协议侧重于微流体装置的使用和基本刺激9，15，17，但我们在这里描述了一个灵活的，自动化的，多模态刺激传递系统的构建和使用，用于秀丽隐杆线虫或其他小生物体的神经成像利用先前描述的微流体装置4。开源系统通过简单的文本文件进行编程以定义实验，NeuroTracker数据分析程序半自动地从显微镜视频中提取神经活动数据。我们通过使用化学感觉神经元AWA评估时间抑制，去抑制和刺激串扰的示例来演示该系统，该神经元在表达光遗传学光敏离子通道5，6时响应不同的食物气味或响应光而去极化。
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Protocol
1. 神经成像设备
注意：有关构建成像和刺激系统的详细说明，请参阅Lawler和Albrecht15，该系统控制显微镜照明定时，图像采集和刺激传递（图1）。廉价的Arduino Nano激励控制器通过数字信号将流体阀驱动到阀门控制器，并通过模拟电压信号控制光遗传学照明到LED控制器。其他刺激，如振动电机和热加热器，可以使用数字或模拟信号进行控制。刺激控制器通过相机信号同步刺激和图像记录，如开源Micro-Manager显微镜控制软件（μManager）16指定的那样。有关与本协议中使用的所有材料，试剂，设备和生物体有关的详细信息，请参阅材料表。
- 设置神经成像设备，包括具有GFP光学器件的落射荧光显微镜，具有数字曝光输出信号的sCMOS相机和刺激控制器15。
- 通过数字或模拟信号 将 激励控制器连接到所需系统。对于下面给出的示例，使用以下系统：
- 使用阀门控制器进行化学刺激。将阀门控制器连接到流体电磁阀或夹管阀（图1）15。
- 使用安装在显微镜载物台上方的 615 nm 红色 LED 和控制器进行光遗传学刺激。
- 使用显微镜控制软件设置计算机，使用设备设置创建配置预设，并确保刺激控制15的正常运行。
2. 微流控装置制造
注意：有关获取或制造母模以及微流体装置的生产、使用和清洁的详细信息，请参阅 Lagoy 等人 17 。这些步骤总结如下。
- 使用提供的微流体设计文件（albrechtlab.github.io/microfluidics）获取或制造主模具17。对于年轻的成年 秀丽隐杆线虫，确保通道高度为55-70μm。
- 以10：1的重量比将PDMS基料和固化剂混合，并与移液器充分混合。
- 在真空干燥器中脱气30-60分钟，直到气泡消失。
- 将母模放入大（直径150毫米）培养皿中，并将脱气的PDMS倒入4-5毫米（~100克）的深度。用移液器检查并清除任何灰尘或气泡。
- 在65°C的水平烤箱架上烘烤3小时至过夜。
- 固化后，使用手术刀从模具上切割PDMS，并使用直剃须刀片分离设备。
- 使用1毫米的真皮冲孔打入口和出口孔，并用dH 2 O，乙醇和dH 2O再次清洁它们。
- 用胶带清洁PDMS设备的两侧，清除任何灰尘或碎屑。
- 准备载玻片以完成所述微流体装置17。使用金刚石钻头在顶部滑块上钻入口孔，并通过暴露于TFOCS蒸汽或应用防水玻璃处理使底部滑块具有疏水性（图2B）。
- 将玻璃-PDMS器件夹层组装到夹具中（图2C）。
3. 动物制备
- 获得或创造具有在感兴趣的神经元中表达的遗传编码钙指示剂的动物。
注意：例如，行 NZ1091 （kyIs587 [gpa-6p：：GCaMP2.2b; UNC-122P：:d sRed]; kyIs5662 [odr-7p：：Chrimson：SL2：mCherry; elt-2p：：mCherry]）表达 GCaMP 和 AWA 感觉神经元对6 中的红光敏感阳离子通道 Chrimson。两种转基因都整合到基因组中，以便在每只动物中稳定表达。 - 实验前一天，将至少20个L4幼虫秀 丽隐杆线 虫放在接种有OP50 大肠杆菌 草坪的线虫生长培养基（NGM）琼脂平板上。当保持在20°C时，这将在第二天的年轻成年阶段同步野生型动物。
注意：对于阵列转基因，使用荧光立体镜选择动物，以确保所选动物中的转基因表达。
4. 溶液制备
- 从 10x 储备溶液中制备 1x S 基础缓冲液（100 mM NaCl 和 0.05 M KPO4，pH 6.0）。
- 通过在 1x S 基础中稀释 1 M 储备液来制备 1 mM 四米唑缓冲液。使用这种麻痹缓冲液来准备所有刺激。实验通常使用约 150 mL。
- 向“对照”缓冲液槽中加入 0.1-1 μg/mL 荧光素以可视化流量。
- 通过连续稀释至所需的最终浓度来创建刺激溶液。例如，通过首先创建10-3储备液来创建10-7稀释的双乙酰引诱剂。
注意：可以将少量荧光素（0.1-1μg/ mL）添加到刺激物或缓冲溶液中以验证刺激时间，但浓度应最小，以避免神经荧光中的伪影。
5. 微流控装置制备
注意：参见Reilly等人9 的视频协议，显示水库的产生，设备设置和动物的装载。另见Lagoy et al.17 ，了解包含许多有用提示的书面协议。
- 准备三个或更多储液罐。对于每个，将一个 30 mL 或 60 mL 注射器储液器、一个 3 mL 启动注射器和一个针头短柄连接到三通鲁尔阀（图 2D）。将针头连接到末端装有金属管的微孔管上。标记储液器，将它们安装到连接到环形支架的架子上，并用相应的缓冲液或刺激液填充它们（图2E）。
- 将组装好的微流体装置在真空干燥器中脱气~1小时。
- 使用灌注注射器填充并去除储液罐管中的气泡。用缓冲液填充流出管。
- 从真空中取出微流体装置，并快速插入出口管并将流体注入装置，直到液滴从一个入口出现。
- 在该入口处，使用“液滴到液滴”连接17 插入相应的流体入口管（图2F）。确保入口管和设备端口孔上都有液滴，以避免引入气泡。
- 从出口注入更多液体，连接下一个入口管，然后重复直到所有入口都充满。在任何未使用的入口和蜗杆装载口插入实心阻挡销。
- 通过打开入口和出口鲁尔阀来启动流量。检查设备入口和玻璃底座是否有泄漏。在实时模式下使用显微镜图像捕获软件检查设备流道或入口内是否有气泡。
注意：如果存在气泡，请等待它们吸收到PDMS材料中。
6. 动物装载
注：见拉戈伊等人17。
- 使用线尖“镐”将年轻的成年动物转移到未播种的NGM琼脂平板上。
- 用大约 5 mL 的 1x S 基础缓冲液淹没板，使动物正在游泳。
- 将蠕虫吸入加载注射器（1 mL或3 mL注射器，附有已预填充1x S基础的管子）。
- 使用立体镜，用一只手将管端移动到每个所需的动物的液体表面下方，并使用另一只手握住的注射器将其拉入管中。
- 仅将蠕虫吸入管道，而不是吸入注射器。
注意：管子通常只能容纳约 100 μL。动物可以被驱逐到局部区域，然后再次以小体积吸入管道。
- 关闭出口管，取下蠕虫装载销，并使用滴对滴连接将蠕虫装载注射器连接到设备。
- 轻轻地将动物流入竞技场，建立缓冲流，并允许四米索固定长达1小时。
注意：在固定期间，请确保只有缓冲液进入竞技场。在此期间，可以关闭刺激和控制储液罐，但在运行刺激试验之前打开它们并验证正确的流量。
7. 自动刺激和神经元记录
- 使用文本编辑器（例如记事本）创建一个名为“用户定义的采集设置.txt”的刺激定义文本文件，其中包含用于自动图像采集的刺激设置（参见 图3中的示例）。设置分为两个部分：
- 显微镜采集设置： 定义实验类型（单刺激或多模式）、曝光和激发时间、试验持续时间和间隔以及保存目录。
- 刺激设置： 定义激励控制参数。“刺激命令”使用语法<字母代码><帧号>指定在某些视频帧上发生的动作，其中字母代码为 A = 阀门 1、B = 阀门 2、C = 阀门 3、L = LED 灯;此外，大写 = 开，小写 = 关。LED 强度使用字母代码“i”和值 0（关闭）到 255（最大亮度）进行设置。
注意： LED 强度值从 0 到 255 设置输出模拟电压范围为 0 V 到 5 V。这里使用的电流控制器具有线性强度缩放，其他控制器应使用光功率计进行校准。- 对于只有一个重复刺激命令的单刺激实验，请使用 图3A中的格式。
- 对于具有多个刺激命令的多模式实验，请使用 图 3B 中的格式。包括一个数字的“模式序列”，代表刺激模式的顺序。对于每个模式，在单独的行上输入刺激命令。
注意：伪随机序列或m序列可用于研究刺激历史依赖性。
- 运行显微镜控制软件。验证所有流体入口是否打开，竞技场内的流动是否符合要求（见 图2H），并且感兴趣的神经元在实时窗口中聚焦。
- 关闭实时窗口并在软件中运行脚本“MultiPattern_RunScript.bsh”。
注意：在没有动物的情况下运行测试实验以验证适当的流动和刺激很有用。为每种刺激液替换不同的荧光素浓度可以帮助可视化和记录新的刺激模式。 - 实验后，拆卸微流体装置，并用水冲洗所有表面，管道和储液器。
注意：如果保持清洁，所有组件都可以重复使用数十次。确保储液罐、管道和微流体装置在气流中保持湿润或完全干燥，以避免盐结晶，盐结晶会堵塞且难以去除。这些装置可以保存在乙醇中进行灭菌，但在重复使用前应完全干燥（在65°C下>1小时）17。
8. 使用神经追踪器进行数据分析
注意：NeuroTracker4，18，19是一个ImageJ / FIJI20软件插件，用于跟踪多个神经元和动物的荧光强度，即使它们在试验期间移动也是如此。该插件将数据保存为文本文件，其中包含每个神经元的位置和背景校正荧光强度（F）。荧光数据归一化为基线荧光（F 0），例如，刺激前几秒钟的平均值，如Δ F / F 0 = （F -F 0）/ F 0，可以在种群之间平均。
- 按照说明安装神经追踪器脚本（github.com/albrechtLab/Neurotracker）。
- 通过点击插件运行神经追踪器 |追踪 |神经追踪器。
- 选择包含 .要跟踪的TIF视频文件，然后选择所需的设置。
注意：如果仅跟踪视频文件的子集，请在提示符下选择要分析的文件的数字范围。默认跟踪设置适用于分辨率为 250 pix/mm 的非活动动物。按比例调整其他分辨率的参数。有关更多设置信息，请参阅用户指南19 。 - 设置强度阈值，使神经元可见以供选择（图4）。
- 使用 图像 |调整菜单。
- 在 B/C 窗口中，调整 最小 值和 最大值 滑块，直到神经元清晰可辨（图 4A）。
- 在“ 阈值” 窗口中，选中“ 深色背景 ”和 “不重置范围”。
- 滑动框架滑块以观察神经元运动和强度变化，注意要从跟踪中排除的任何动物，例如由于与其他动物重叠。
- 识别要跟踪的神经元。
- 对于每只动物，调整阈值水平，使神经元上方的红色阈值区域在刺激之前，期间和之后的每一帧中都可见。
- 单击神经元以记录其位置和阈值水平。
- 对要跟踪的每个动物和神经元重复阈值调整和选择。有关良好的阈值电平示例，请参见图 4C ，有关超过阈值和低于阈值的示例，请参见 图4D，E 。先前选择的神经元由一个小框指示。
- 选择所有神经元后，按 空格键 开始跟踪。
注意：有关其他神经追踪器示例，请参阅以前的参考文献4，19。 - 监控每只动物的跟踪过程，并进行任何必要的更正。
- 如果NeuroTracker暂停，它就失去了神经元。重新单击神经元，根据需要调整阈值水平。
- 如果积分框跳转到附近的另一个动物或非神经元结构，请按 空格键 暂停，将 滑块 移回第一个错误帧，然后重新单击正确的神经元位置。
9. 数据探索和可视化
注意：MATLAB 分析脚本用于数据处理和可视化，并为每个分析生成摘要 PDF。
- 在 MATLAB 中运行“NeuroTrackerSummary_pdf.m”文件，然后选择包含 NeuroTracker 数据文本文件的文件夹。
- 等待生成摘要 PDF，以便验证跟踪过程（图 5）。动物通过数字识别（图5A），并且可以查看每只动物和试验的神经反应以评估种群变异性（图5B）。
- 使用函数“databrowse.m”来探索神经数据，例如，按试验编号（图5C），动物编号（图5D），刺激模式或其他类别分组。
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Representative Results
我们提出了几个刺激模式的例子，这些刺激模式评估了不同的神经现象，包括时间抑制、适应和去抑制。 时间抑制 是在初始呈现后不久发生的对第二次刺激呈现的神经反应的瞬时抑制14。为了测试这种现象，在配对脉冲实验中，提出了由两个1 s气味脉冲组成的八种模式，间隔范围为0 s至20 s（图6B;相应的刺激控制文件见 图3B ）。竞技场由单个刺激液（1.1μM双乙酰）、缓冲液和控制流管设置，未使用的入口端口用实心针挡住（图6A）。通过打开阀1，控制流体进入 ctrl1 入口，移动流体流，使刺激进入竞技场;当阀 1 关闭时，控制流体进入 Ctrl2 入口，缓冲液流过竞技场（见 图 2G，H）。虽然第一个 1 秒气味脉冲在双乙酰检测 AWA 神经元中引起相同的响应幅度，但对第二个脉冲的反应随刺激间隔而变化（图 6D）。对于小于10 s的脉冲间隔，第二响应较弱，表现出时间抑制现象。使用该实验装置，发现动力蛋白组分CHE-3的破坏可以防止时间抑制，暗示轴突运输与这种现象5有关。
适应是对同一刺激的重复呈现的神经反应逐渐减少。这种现象可能是由不同的过程引起的，例如可以快速逆转的主动抑制，或者其他可以缓慢逆转的过程。评估快速可逆性的一项实验是“捕获”试验，其中重复一个刺激以建立适应，然后是“偏差”或新刺激，然后回到原始刺激。如果在新的“去抑制”刺激后神经反应增加，则观察到去抑制。图7展示了使用两种气味剂双乙酰和2-甲基吡嗪（2-MP）的示例，由AWA化学感觉神经元通过不同的受体4检测。两个刺激储液器和管道连接到微流体装置，并带有一个额外的三通夹管阀以确定哪个刺激进入竞技场（图7A）。刺激模式被定义为在所有30个试验中通过阀门1呈现4秒的化学脉冲，并通过阀门3在刺激S1或S2之间进行选择，该刺激在第25次试验后打开，在第26次试验后关闭（图7B）。这种布置确保了不同的刺激流体在呈现给动物之前有足够的时间流过微流体装置。观察到对双乙酰刺激的适应，但新型2-MP刺激的呈现并未引起强烈的去抑制作用（图7C）。
光遗传学刺激使用光通过光敏离子通道 激活 神经元。虽然使用方便，但光遗传学激活绕过了感觉受体和一些调节途径，因此与自然刺激的激活相比，一些神经现象可能会有所不同。为了测试这些差异，多模态实验对于在单个实验中呈现不同类型的刺激很有用。表达通道视紫红质变体Chrimson的神经元被红光照射激活5。为了评估AWA神经元是否对化学和光遗传学刺激的适应相似，将AWA神经元中表达Chrimson和GCaMP的NZ1091菌株保持在含有辅因子全反式视网膜（ATR，100μM）的平板上14-28小时。615 nm 红色 LED 从上方照亮微流体领域（图 8A），并且通过在同一试验中提供 5 秒的双乙酰、红光或两者脉冲来生成一组多模态刺激模式（图 8B）。单独的化学刺激会引起适应，而单独的光学刺激不会（图8C）。然而，组合的多模态刺激模式表明，光遗传学反应容易受到化学诱导的适应（图8C，D）。这些实验表明，适应是在感觉受体或树突突过程中开始的，但其影响遍及整个神经元。
图1：神经钙记录和刺激设备的示意图。显微镜图像捕获、荧光激发光和刺激由计算机和开源Arduino微控制器控制。微流体领域中的化学刺激通过控制流体流C在缓冲液B和刺激S溶液之间切换。可选系统元件用星号 （*） 表示，例如附加阀门和光学或其他刺激方式。荧光显微镜图像用于通过钙瞬变测量神经活动，例如，使用钙指示剂GCaMP。虚线表示电气连接（数字或模拟），曲线表示流体管，直实箭头表示光路。缩写：LED = 发光二极管。这个数字是从Lawler和Albrecht15修改而来的。请点击此处查看此图的大图。
图 2：微流体装置组装和设置。微流体装置由夹在（B）钻孔玻璃顶部和疏水玻璃底座之间的（A）微图案PDMS器件和（C）夹紧组成。（D） 储液罐位于设备上方，带有 （E） 油管架支架。来自储液罐的管道直接连接到设备中，或通过致动阀进行流体控制。该设备位于显微镜物镜上方。（F） 微流体装置的特写图像，所有管道都连接在入口、蜗杆装载口和出口中。（G） 20 mm x 20 mm 微流体装置的示意图。黑线代表55-70μm高的流体通道。这种几何形状旨在通过垂直于流动的刺激前沿进行精确的时空控制，同时将动物保持在竞技场和显微镜视野内。缓冲流和一个刺激流（或可选的 Stim2，如果使用）连续流动，而一次只有一个控制流体入口流动，从而改变进入竞技场的流体。（H）当阀门1通电时，控制流体从常闭端口流向控制1入口，刺激打开并流过竞技场。当阀 1 关闭时，流体从常开端口流向控制 2 入口，缓冲器进入竞技场。显示了适当的流量平衡，使用荧光素染料作为刺激液。请注意，进入竞技场的一些流体也会通过上下弯曲通道绕过它。这些溪流应该很窄，在上部和下部河道中具有相等的宽度。储液罐高度可根据需要进行调整。缩写：PDMS = 聚二甲基硅氧烷;WL = 蜗杆加载;Buf = 缓冲区;Stim1 = 第一个刺激;Stim2 = 第二次刺激;NC = 常闭;否 = 常开。这个数字是从Lawler和Albrecht15修改而来的。请点击此处查看此图的大图。
图 3：示例刺激定义文件。 （A）单次重复刺激实验示例：强度为200的5 s光脉冲从2 s到7 s（帧20到70）。（B）具有八种不同刺激模式的多模式刺激实验示例，对应于图6。两个 1 s 化学脉冲之间的间隔为 0 s 到 20 s。请点击此处查看此图的大图。
图4：神经追踪器中神经元的选择和阈值水平 。 （A）全显微镜视野，亮度和对比度调整以清晰地看到AWA神经元。（B）动物头部区域的放大视图，描绘了计算荧光强度的积分盒和背景减去的背景环。（C）显示强大神经反应的综合强度图。（D）良好的阈值选择将导致图像堆栈中每一帧的红色阈值区域高于 最小 尺寸参数，低于 最大尺寸 参数，并且不包括附近的区域，例如肠道自发荧光（见图 B）。（E）当神经元活跃时，阈值设置得太高可能看起来很好，但当不活跃时，神经元可能会丢失。因此，在选择阈值时，检查刺激前和刺激后框架非常重要。（F）阈值设置太低可能会突出其他非神经元结构。超过阈值或低于阈值的选择可能导致神经追踪器丢失神经元并暂停用户反馈以纠正阈值和神经元位置。缩写：B&C =亮度和对比度。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：数据分析示例。 15只动物的神经反应暴露于每分钟一次5秒持续时间的10次重复光遗传学刺激。（A）指示跟踪的动物和试验内神经元运动的摘要图像（红框）。动物2在试验期间移动。（B）随着时间的推移，个体动物的反应对红光刺激表现出相对一致的反应。（C） 使用 数据浏览 功能的数据探索输出。迹线按试验重复（上图）分组，用户可选试验的平均值如下所示。（D）按个体动物数量分组的数据，并在重复试验中取平均值。该数据集显示了最小的动物间变异性，证明了整个种群的平均反应是合理的。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：具有可变刺激间隔的配对脉冲实验，以评估时间抑制 。 （A）微流体装置入口连接。未使用的入口用实心销 （X） 堵塞。控制流体储液罐和阀门 1 连接到 c1 和 c2 入口，为清楚起见，此处省略。（B）八种模式的刺激时机。脉冲持续时间为1 s，间隔0-20 s。模式顺序如下所示;每个图案被呈现六到七次。（C）来自50项试验和9只动物的AWA神经活动。按刺激模式排序的反应热图如上所示;每种模式的平均神经活动（n = 56-63个响应）如下所示。初始脉冲后发生时间抑制~10秒。 请点击此处查看此图的大图。
图7：捕获试验实验以评估去抑制 。 （A）微流体装置入口连接。三通夹管阀仅允许刺激 S1 在静止时通过，而仅允许 S2 在通电时通过。（B）用于传递重复双乙酰气味脉冲的三种模式序列的图，在第26次试验中提出了新的刺激2-甲基吡嗪。（C）20只动物的平均AWA神经活动反应。缩写：DA = 双乙酰;2-MP = 2-甲基吡嗪。 请点击此处查看此图的大图。
图 8：多模模式刺激示例 。 （A）微流体装置入口连接，未使用的入口用实心销阻挡。红色 LED 从上方照亮竞技场。（B）光学、化学或多模式刺激的模式。（C）30次重复试验的平均AWA神经活动（n = 11只动物），配对的光遗传学和化学感觉（顶部），仅光遗传学（中）和仅化学感觉（底部）刺激。（D）上面光遗传学脉冲和下面化学脉冲的每次试验的峰值神经反应平均值。光遗传学脉冲不会直接引起适应，但它们的反应容易受到化学感觉适应的影响。缩写：DA = 双乙酰。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在该协议中，我们描述了一种开放式显微镜系统，用于使用不同刺激模式的时间精确传递来评估神经活动现象。微流体平台提供可重复的刺激，同时将数十只动物保持在显微镜视野中。很少有商业显微镜软件包允许对各种刺激定时模式进行轻松编程，而那些通常需要手动输入每种模式或专有文件格式的软件包。相比之下，实验在该系统中由文本文件定义，文本文件可以是计算机生成的，并且可以由分析软件读取。在这里，我们展示了在多模态刺激期间使用可变刺激模式来评估神经元现象（例如时间抑制，适应和串扰）的效用。数据分析管道将大型显微镜视频文件简化为神经活动数据，这些数据可以可视化和分析群体变异性（图 5B）、随时间变化（图 7C 和图 8C，D）以及扰动后的变化（图 7C）。
自动化的一个关键好处是刺激在试验重复和实验之间的可重复性，并且与以前的单动物方法相比，微流体竞技场形式允许通量至少提高 20 倍7，9，13。将动物种群置于相同的刺激和环境条件下可确保数据具有可比性，并避免溶液制备、温度、动物来源或其他因素的潜在日常变化。然而，这种方法的局限性是低放大倍率、低分辨率的显微镜将所有动物保持在视野中。每只动物只应监测一个神经元，以尽量减少跟踪误差，尽管原则上可以区分相隔至少50μm的神经元。如果预期反应是对称的，则可以将双侧神经元对成像在一起。重要的是首先确定哪些特定神经元参与感兴趣的神经过程，例如通过全脑成像7，然后仅在相关神经元中表达GCaMP以提高通量。
由于报告基因表达水平或其他个体间差异，神经元钙反应因动物而异。例如，标准化的AWA GCaMP反应在峰值幅度上变化了两倍，即使在钙报告基因稳定地整合到基因组中的同基因野生型动物中也是如此4。一些刺激在整个人群中表现出不同的反应（例如，乙酸丁酯4），表明受体表达不同。在实践中，应至少评估20只个体动物以确定种群变异性。建议利用个体动物数据来提高确定反应变化的统计功效，例如通过对扰动前后配对的个体神经反应进行统计比较。
对于大型数据集和自动试验，验证和验证适当的实验功能、跟踪和数据缩减非常重要，尤其是对于无人值守的步骤。应使用荧光溶液（如图2H所示）验证流动模式，方法是在录制的视频中观察到没有气泡或控制流体进入竞技场。数据集应通过例如，注意任何动物运动（如图5A）和验证平滑的神经反应（如图4C和图5B）来验证。应排除任何有问题的数据。在使用“databrowse”功能进行平均之前验证数据分组也很重要，以确保平均响应反映单个响应。
开源刺激控制系统可通过数字或模拟信号或串行通信命令 轻松 扩展到其他刺激。分级刺激通常可通过模拟电压 （0-5 V） 输入进行控制，例如 LED 光强度或神经刺激器脉冲幅度。开关刺激通常由数字 （TTL） 信号控制，例如电刺激器定时。这些数字信号还可以驱动继电器开关以激活其他电气系统，例如用于机械感觉刺激的振动电机。其他设备使用串行通信，例如通过USB连接，传输特定的字符命令以定义动作。例如，剂量反应实验可以使用USB控制的旋转阀5 或多孔板系统6自动呈现几种化学浓度。这些命令可以添加到开源显微镜控制脚本中，以特定的试验编号发送。时间延迟也可以类似地合并;例如，要在两次 30 次试验刺激回合之间暂停测试1小时，可以指定一个60次试验实验，并添加一行代码，以便在试验编号达到31时暂停1小时。
实验复杂性几乎是无限的，甚至可以在基于“闭环”系统中的实时反馈的实验过程中发生变化。例如，刺激可以根据神经活动、动物行为或其他可量化的参数实时变化。我们最近使用这样的系统通过在行为改变后触发刺激和神经记录来评估睡眠动物与清醒动物的感觉神经反应8，15。NeuroTracker的运动跟踪功能可以分析自由运动动物的神经活动，以确定与行为输出的相关性。然而，跟踪单个移动的动物需要密切注意，例如当它们穿过路径时，因此，建议每个竞技场装载较少的动物（大约五只），以尽量减少这些相互作用。
总体而言，这些技术提高了刺激的精度和探索群体变异性和特定神经现象的实验吞吐量。除了测量神经元活动外，这些方法还可以推广到其他生物系统，包括植物，它们也通过钙信号21，神经细胞培养和脑类器官22以及其他动态荧光信号进行通信，例如突触活动传感器，神经递质释放23和转录24。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们感谢Fox Avery测试这些协议并审阅手稿，并感谢Eric Hall的编程帮助。本文介绍的方法的资金部分由美国国家科学基金会1724026（D.R.A.）提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacterial strains | |||
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Cat# OP50 | |
| Experimental models: Organisms/strains | |||
| C. elegans strains expressing GCaMP (and optionally, Chrimson) in desired neurons | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) or corresponding authors of published work | NZ1091, for example | |
| Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies | |||
| 2,3-Butanedione | Sigma-Aldrich | Cat# B85307 | diacetyl, example chemical stimulus |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# C3881 | |
| Fluorescein, Sodium salt | Sigma-Aldrich | Cat# F6377 | |
| Glass water repellant | Rain-X | Cat #800002250 | glass hydrophobic treatment (single-use) |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma-Aldrich | Cat# M2393 | |
| Nematode Growth Medium (NGM) agar | Genesee | Cat #: 20-273NGM | |
| Petri dishes (60 mm) | Tritech | Cat #T3305 | |
| Poly(dimethyl siloxane) (PDMS): Sylgard 184 | Dow Chemical | Cat# 1673921 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | Cat# P5655 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | Cat# P8281 | |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | Cat# S7653 | |
| (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane (TFOCS) | Gelest | CAS# 78560-45-9 | glass hydrophobic treatment (durable) |
| Software and algorithms | |||
| Arduino IDE | Arduino | https://www.arduino.cc/en/software | |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Micro-manager | Micro-manager | https://micro-manager.org/ | |
| Microscope control software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl | |
| Neurotracker data analysis software | Albrecht Lab | https://github.com/albrechtLab/Neurotracker | |
| Automated Microscope and Stimulation System | |||
| Axio Observer.A1 inverted microscope set up for epifluorescence (GFP filter cubes, 5× objective or similar) | Zeiss | Cat #491237-0012-000 | |
| Excelitas X-cite XYLIS LED illuminator | Excelitas | Cat #XYLIS | |
| Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera | Hamamatsu | Cat #C11440-22CU | |
| Arduino nano | Arduino | Cat #A000005 | |
| 3-way Miniature Diapragm Isolation Valve (LQX12) | Parker | Cat #LQX12-3W24FF48-000 | Valve 1: Control |
| 2-way normally-closed (NC) Pinch Valve | Bio-Chem Valve Inc | Cat #075P2-S432 | Valve 2: Outflow |
| 3-way Pinch Valve | NResearch | Cat #161P091 | Valve 3: Stimulus selection |
| Optogenetic stimulation LED and controller (615 nm) | Mightex | Cat #PLS-0625-030-S and #SLA-1200-2 | |
| ValveLink 8.2 digital/manual valve controller | AutoMate Scientific | Cat #01-18 | |
| Wires and connectors | various | See Fig. 2 of Cell STARS Protocol (Lawler, 2021) | |
| Microfluidic Device Preparation | |||
| Dremel variable speed rotary cutter 4000 | Dremel | Cat #F0134000AB | Set speed to 5k RPM for cutting glass |
| Dremel drill press rotary tool workstation | Dremel | Cat #220-01 | |
| Diamond drill bit | Dremel | Cat #7134 | |
| Glass slide, 1 mm thick | VWR | Cat #75799-268 | |
| Glass scribe (Diamond scriber) | Ted Pella | Cat #54468 | |
| Luer 3-way stopcock | Cole-Parmer | Cat #EW-30600-07 | |
| Luer 23 G blunt needle | VWR | Cat #89134-100 | |
| Microfluidic device | Corresponing author or fabricate from CAD files associated with this article | N/A | |
| Microfluidic device clamp | Warner Instruments (or machine shop) | P-2 | |
| Microfluidic tubing, 0.02″ ID | Cole-Parmer | Cat #EW-06419-01 | |
| Tube 19 G, 0.5″ | New England Small Tube | Cat #NE-1027-12 |
References
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