बीएस 3 रासायनिक क्रॉसलिंकिंग परख: कृंतक मस्तिष्क में सेल सतह जीएबीएए रिसेप्टर प्रस्तुति पर क्रोनिक तनाव के प्रभाव का मूल्यांकन
Summary
बीएस 3 रासायनिक क्रॉसलिंकिंग परख पुरानी मनोसामाजिक तनाव स्थितियों के तहत माउस दिमाग में कम सेल सतह जीएबीएए रिसेप्टर अभिव्यक्ति का खुलासा करती है।
Abstract
चिंता भावनाओं की एक स्थिति है जो संज्ञानात्मक कार्यों सहित जानवरों के व्यवहार को प्रभावित करती है। चिंता के व्यवहार संबंधी संकेत जानवरों के साम्राज्य में देखे जाते हैं और तनाव के तौर-तरीकों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूली या दुर्भावनापूर्ण प्रतिक्रियाओं के रूप में पहचाने जा सकते हैं। कृंतक आणविक, सेलुलर और सर्किट स्तरों पर चिंता के एकीकृत तंत्र को संबोधित करने वाले ट्रांसलेशनल अध्ययनों के लिए एक सिद्ध प्रयोगात्मक मॉडल प्रदान करते हैं। विशेष रूप से, क्रोनिक मनोसामाजिक तनाव प्रतिमान चिंता-/ अवसादग्रस्तता जैसे व्यवहार फेनोटाइप की नकल करते हुए दुर्भावनापूर्ण प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करता है जो मनुष्यों और कृन्तकों के बीच अनुरूप होते हैं। जबकि पिछले अध्ययन मस्तिष्क में न्यूरोट्रांसमीटर सामग्री पर पुराने तनाव के महत्वपूर्ण प्रभाव दिखाते हैं, न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर स्तरों पर तनाव का प्रभाव कम अध्ययन किया जाता है। इस लेख में, हम क्रोनिक तनाव के तहत चूहों में न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स के न्यूरोनल सतह के स्तर को मात्रात्मक करने के लिए एक प्रयोगात्मक विधि प्रस्तुत करते हैं, विशेष रूप से गामा-एमिनोब्यूट्रिक एसिड (जीएबीए) रिसेप्टर्स पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जो भावना और अनुभूति के नियमन में फंसे हुए हैं। झिल्ली-अभेद्य अपरिवर्तनीय रासायनिक क्रॉसलिंकर, बिस्सल्फोसुसिनिमिडिल सबरेट (बीएस 3) का उपयोग करते हुए, हम दिखाते हैं कि क्रोनिक तनाव प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स में जीएबीएए रिसेप्टर्स की सतह की उपलब्धता को काफी कम कर देता है। जीएबीएए रिसेप्टर्स के न्यूरोनल सतह स्तर जीएबीए न्यूरोट्रांसमिशन के लिए दर-सीमित प्रक्रिया हैं और इसलिए, प्रयोगात्मक पशु मॉडल में चिंता-/ अवसादग्रस्तता जैसे फेनोटाइप की डिग्री के आणविक मार्कर या प्रॉक्सी के रूप में उपयोग किया जा सकता है। यह क्रॉसलिंकिंग दृष्टिकोण किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र में व्यक्त न्यूरोट्रांसमीटर या न्यूरोमोड्यूलेटर के लिए विभिन्न प्रकार के रिसेप्टर सिस्टम पर लागू होता है और भावना और अनुभूति के अंतर्निहित तंत्र की गहरी समझ में योगदान करने की उम्मीद है।
Introduction
न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स को या तो न्यूरोनल प्लाज्मा झिल्ली की सतह पर या एंडोमेम्ब्रेन (जैसे, एंडोसोम, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम [ईआर], या ट्रांस-गोल्गी तंत्र) पर इंट्रासेल्युलर रूप से स्थानीयकृत किया जाता है और न्यूरॉन्स में आंतरिक शारीरिक अवस्थाओं के आधार पर या बाह्य तंत्रिकानेटवर्क गतिविधियों के जवाब में इन दो डिब्बों के बीच गतिशील रूप से शटल किया जाता है।. चूंकि नए स्रावित न्यूरोट्रांसमीटर मुख्य रूप से रिसेप्टर्स के सतह-स्थानीयकृत पूल के माध्यम से अपने शारीरिक कार्यों को प्राप्त करते हैं, इसलिए किसी दिए गए न्यूरोट्रांसमीटर के लिए सतह रिसेप्टर स्तर तंत्रिका सर्किट3 के भीतर इसकी सिग्नलिंग क्षमता के महत्वपूर्ण निर्धारकों में से एक हैं।
सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में सतह रिसेप्टर स्तरों की निगरानी के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं, जिनमें सतह बायोटिनाइलेशन परख4, गैर-परमेबिलाइज्ड स्थितियों में एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख5, या पीएच-संवेदनशील फ्लोरोसेंट ऑप्टिकल संकेतक (जैसे, पीएचलुओरिन) 6 के साथ आनुवंशिक रूप से जुड़े रिसेप्टर ट्रांसजेन का उपयोग शामिल है। इसके विपरीत, विवो में सतह रिसेप्टर स्तरों का आकलन करते समय ये दृष्टिकोण या तो सीमित या अव्यावहारिक होते हैं। उदाहरण के लिए, सतह बायोटिनाइलेशन प्रक्रिया विवो मस्तिष्क के ऊतकों में बड़ी मात्रा और नमूना संख्या को संसाधित करने के लिए व्यावहारिक नहीं हो सकती है क्योंकि इसकी अपेक्षाकृत उच्च कीमत और एविडिन-संयुग्मित मोतियों पर बायोटिनीलेटेड प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए आवश्यक बाद के कदम हैं। त्रि-आयामी मस्तिष्क वास्तुकला में एम्बेडेड न्यूरॉन्स के लिए, कम एंटीबॉडी पहुंच या माइक्रोस्कोप-आधारित परिमाणीकरण में कठिनाइयां विवो में सतह रिसेप्टर स्तरों का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा पैदा कर सकती हैं। बरकरार दिमाग में न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर्स के वितरण की कल्पना करने के लिए, गैर-इनवेसिव तरीकों, जैसे कि पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी, का उपयोग रिसेप्टर अधिभोग को मापने और सतह रिसेप्टर स्तर7 का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, यह दृष्टिकोण गंभीर रूप से विशिष्ट रेडियो लिगेंड, महंगे उपकरण और विशेष विशेषज्ञता की उपलब्धता पर निर्भर करता है, जिससे यह अधिकांश शोधकर्ताओं द्वारा नियमित उपयोग के लिए कम सुलभ हो जाता है।
यहां, हम प्रयोगात्मक पशु दिमाग में सतह रिसेप्टर के स्तर को मापने के लिए एक सरल, बहुमुखी विधि का वर्णन करते हैं, जो पानी में घुलनशील, झिल्ली-अभेद्य रासायनिक क्रॉसलिंकर, बीआईएस (सल्फोसुसिनिमिडिल) सबरेट (बीएस 3) 8,9 का उपयोग करके विवो है। बीएस 3 लाइसिन अवशेषों की साइड चेन में प्राथमिक अमाइन को लक्षित करता है और एक दूसरे के करीब के क्षेत्र में प्रोटीन को सहसंयोजक रूप से क्रॉसलिंक कर सकता है। जब मस्तिष्क के स्लाइस को रुचि के क्षेत्र से ताजा तैयार किया जाता है और बीएस 3 युक्त बफर में इनक्यूबेट किया जाता है, तो सेल सतह रिसेप्टर्स पड़ोसी प्रोटीन के साथ क्रॉसलिंक होते हैं और इस प्रकार, उच्च-आणविक भार प्रजातियों में बदल जाते हैं, जबकि इंट्रासेल्युलर एंडोमेम्ब्रेन से जुड़े रिसेप्टर्स अपरिवर्तित रहते हैं। इसलिए, सतह और इंट्रासेल्युलर रिसेप्टर पूल को सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) द्वारा अलग किया जा सकता है और अध्ययन किए जाने वाले रिसेप्टर के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी धब्बा द्वारा मात्रात्मक किया जा सकता है।
अप्रत्याशित क्रोनिक हल्के तनाव (यूसीएमएस) कृन्तकों में पुरानी मनोसामाजिक तनाव को प्रेरित करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित प्रयोगात्मक प्रतिमानहै। यूसीएमएस जीएबीए और इसके रिसेप्टर्स10,11 सहित न्यूरोट्रांसमीटर सिस्टम की एक सरणी के मॉड्यूलेशन के माध्यम से चिंता-/ अवसादग्रस्तता जैसे व्यवहार फेनोटाइप और संज्ञानात्मक घाटे को प्राप्त करता है। विशेष रूप से, ए 5 सबयूनिट युक्त जीएबीए ए रिसेप्टर (ए 5-जीएबीएएआर) को स्मृति और संज्ञानात्मक कार्यों12,13 के विनियमन में फंसाया गया है, जो यूसीएमएस-प्रेरित संज्ञानात्मक घाटे में इस सबयूनिट के परिवर्तित कार्यों की संभावित भागीदारी का सुझाव देता है। इस प्रोटोकॉल में, हमने गैर-तनावग्रस्त नियंत्रण चूहों की तुलना में यूसीएमएस के संपर्क में आने वाले चूहों के प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स में सतह-व्यक्त अल्फा 5-जीएबीएएआर के स्तर को मात्रात्मक करने के लिए बीएस 3 क्रॉसलिंकिंग परख का उपयोग किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
यद्यपि व्यवहार (यानी, भावनात्मकता और संज्ञानात्मक घाटे) और आणविक परिवर्तनों पर पुरानी मनोसामाजिक तनाव का प्रभाव (यानी, जीएबीर्जिक जीन की कम अभिव्यक्ति और जीएबीर्जिक न्यूरोट्रांसमिशन में कमी) अच्छी त…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक अध्ययन अवधि में जानवरों की देखभाल के लिए सीएएमएच पशु सुविधा कर्मचारियों को धन्यवाद देते हैं। इस काम को कैनेडियन इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ रिसर्च (सीआईएचआर प्रोजेक्ट ग्रांट # 470458 टीटी), सीएएमएच से डिस्कवरी फंड (टीपी को), नेशनल एलायंस फॉर रिसर्च ऑन स्किज़ोफ्रेनिया एंड डिप्रेशन (एनएआरएसएडी अवार्ड # 25637 टू ई.एस.), और कैंपबेल फैमिली मेंटल हेल्थ रिसर्च इंस्टीट्यूट (ई.एस.) द्वारा समर्थित किया गया था। ई.एस. डेमोना फार्मास्यूटिकल्स के संस्थापक हैं, जो एक बायोफार्मा है जो क्लिनिक में नए जीएबीर्जिक यौगिकों को लाने के लिए समर्पित है।
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors – Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors – Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
References
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