BS3化学架橋アッセイ:げっ歯類の脳における細胞表面GABAA 受容体提示に対する慢性ストレスの影響の評価
Summary
BS3化学架橋アッセイは、慢性心理社会的ストレス条件下でのマウス脳における細胞表面GABAA 受容体発現の減少を明らかにします。
Abstract
不安は、認知機能を含む動物の行動にさまざまに影響を与える感情の状態です。不安の行動徴候は動物界全体で観察され、広範囲のストレスモダリティに対する適応的または不適応的な反応として認識することができます。げっ歯類は、分子、細胞、および回路レベルでの不安の統合メカニズムに対処するトランスレーショナル研究のための実証済みの実験モデルを提供します。特に、慢性心理社会的ストレスパラダイムは、人間とげっ歯類に類似した不安/抑うつのような行動表現型を模倣する不適応反応を誘発します。以前の研究では、脳内の神経伝達物質の内容に対する慢性ストレスの有意な影響が示されていますが、神経伝達物質受容体レベルに対するストレスの影響は十分に研究されていません。本稿では、慢性ストレス下マウスの神経伝達物質受容体の神経表面レベルを定量する実験方法を、特に情動や認知の調節に関与するγ-アミノ酪酸(GABA)受容体に着目して紹介します。膜不透過性の不可逆化学架橋剤であるビススルホスクシンイミジルスベレート(BS3)を使用して、慢性ストレスが前頭前野におけるGABAA 受容体の表面利用可能性を大幅に下方制御することを示しています。GABAA 受容体のニューロン表面レベルは、GABA神経伝達の律速プロセスであるため、実験動物モデルにおける不安/抑うつ様表現型の程度の分子マーカーまたはプロキシとして使用できます。この架橋アプローチは、あらゆる脳領域で発現する神経伝達物質や神経調節物質の様々な受容体系に適用可能であり、情動や認知のメカニズムのより深い理解に貢献することが期待されます。
Introduction
神経伝達物質受容体は、神経細胞の原形質膜表面または細胞内の内膜(エンドソーム、小胞体[ER]、トランスゴルジ体など)に局在し、ニューロンの内因性生理学的状態に応じて、または外因性ニューラルネットワーク活動に応答して、これら2つのコンパートメント間を動的に往復します1,2.新たに分泌された神経伝達物質は、主に表面局在化した受容体のプールを介して生理学的機能を誘発するので、所与の神経伝達物質の表面受容体レベルは、神経回路内のそのシグナル伝達能力の重要な決定要因の1つである3。
培養ニューロンの表面受容体レベルをモニタリングするには、表面ビオチン化アッセイ4、非透過処理条件下での特異的抗体を用いた免疫蛍光アッセイ5、pH感受性蛍光光学指示薬(pHluorinなど)6と遺伝的に融合した受容体導入遺伝子の使用など、いくつかの方法があります。対照的に、これらのアプローチは、 インビボで表面受容体レベルを評価する場合、限定的であるか実用的ではありません。例えば、表面ビオチン化手順は、その比較的高い価格およびアビジン結合ビーズ上のビオチン化タンパク質を精製するために必要な後続のステップのために、in vivo 脳組織の大量およびサンプル数の処理には実用的ではないかもしれない。3次元脳構造に埋め込まれたニューロンの場合、抗体のアクセシビリティが低いか、顕微鏡ベースの定量が難しいため、 in vivoでの表面受容体レベルを評価する上で大きな制限が生じる可能性があります。無傷の脳における神経伝達物質受容体の分布を視覚化するために、陽電子放出断層撮影法などの非侵襲的方法を使用して、受容体占有率を測定し、表面受容体レベルを推定することができます7。ただし、このアプローチは、特定の放射性リガンド、高価な機器、および特別な専門知識の可用性に大きく依存しているため、ほとんどの研究者が日常的に使用することは困難になっています。
ここでは、水溶性で膜を透過しない化学架橋剤であるビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3)8,9を使用して、実験動物の脳の表面受容体レベルをex vivoで測定するための簡単で汎用性の高い方法について説明します。BS3はリジン残基の側鎖にある第一級アミンを標的とし、互いに近接したタンパク質を共有結合的に架橋することができます。脳スライスを関心のある領域から新たに調製し、BS3を含むバッファー中でインキュベートすると、細胞表面受容体は隣接するタンパク質と架橋され、したがって、より高分子量の種に変換されますが、細胞内膜内関連受容体は修飾されません。したがって、表面受容体プールと細胞内受容体プールは、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分離し、研究対象の受容体に特異的な抗体を用いたウェスタンブロットによって定量することができます。
予測不可能な慢性軽度ストレス(UCMS)は、げっ歯類に慢性心理社会的ストレスを誘発するための確立された実験パラダイムです10。UCMSは、GABAとその受容体を含む一連の神経伝達物質系の調節を介して、不安/抑うつのような行動表現型と認知障害を誘発します10,11。特に、α5サブユニット含有GABAA受容体(α5-GABAAR)は、記憶および認知機能の調節に関与しており12,13、UCMS誘発性認知障害におけるこのサブユニットの機能の変化の関与の可能性を示唆している。このプロトコルでは、BS3架橋アッセイを使用して、UCMSに曝露されたマウスの前頭前野における表面発現α5-GABAARのレベルを、非ストレス対照マウスと比較して定量しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
慢性的な心理社会的ストレスが行動(すなわち、感情および認知障害)および分子変化(すなわち、GABA作動性遺伝子の発現低下およびそれに伴うGABA作動性神経伝達の欠損)に与える影響は十分に文書化されているが10、そのような欠陥の根底にあるメカニズムはさらなる調査が必要である。特に、慢性ストレスが小胞体機能の過負荷、ひいては小胞体ストレスの上昇を通じてニ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、研究期間中にわたって動物の世話をしてくれたCAMH動物施設のスタッフに感謝しています。この研究は、カナダ健康研究所(CIHRプロジェクト助成金#470458からT.T.へ)、CAMHからのディスカバリー基金(T.P.へ)、統合失調症とうつ病に関する研究のための全国同盟(ESへのNARSAD賞#25637)、およびキャンベルファミリーメンタルヘルス研究所(ESへ)。E.S.は、新規GABA作動性化合物を臨床に持ち込むことに専念するバイオ医薬品であるダモナファーマシューティカルズの創設者です。
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors – Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors – Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
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