BS3 Chemical Crosslinking Assay: Avaliando o Efeito do Estresse Crônico na Apresentação do Receptor GABAA na Superfície Celular no Cérebro de Roedores
Summary
O ensaio químico de reticulação BS3 revela expressão reduzida do receptor GABAA na superfície celular em cérebros de camundongos sob condições de estresse psicossocial crônico.
Abstract
A ansiedade é um estado de emoção que afeta variavelmente os comportamentos dos animais, incluindo as funções cognitivas. Sinais comportamentais de ansiedade são observados em todo o reino animal e podem ser reconhecidos como respostas adaptativas ou mal-adaptativas a uma ampla gama de modalidades de estresse. Roedores fornecem um modelo experimental comprovado para estudos translacionais abordando os mecanismos integrativos da ansiedade nos níveis molecular, celular e de circuito. Em particular, o paradigma do estresse psicossocial crônico provoca respostas desadaptativas mimetizando fenótipos comportamentais semelhantes aos da ansiedade/depressão que são análogos entre humanos e roedores. Enquanto estudos anteriores mostram efeitos significativos do estresse crônico no conteúdo de neurotransmissores no cérebro, o efeito do estresse nos níveis de receptores de neurotransmissores é pouco estudado. Neste artigo, apresentamos um método experimental para quantificar os níveis de superfície neuronal de receptores de neurotransmissores em camundongos sob estresse crônico, especialmente com foco nos receptores do ácido gama-aminobutírico (GABA), que estão implicados na regulação da emoção e cognição. Usando o reticulador químico irreversível impermeável à membrana, bissulfosuccinimidil suberato (BS3), mostramos que o estresse crônico diminui significativamente a disponibilidade superficial dos receptores GABAA no córtex pré-frontal. Os níveis de superfície neuronal dos receptores GABAA são o processo limitante da taxa para a neurotransmissão GABA e poderiam, portanto, ser usados como um marcador molecular ou um proxy do grau de fenótipos ansiosos/depressivos em modelos animais experimentais. Esta abordagem de reticulação é aplicável a uma variedade de sistemas receptores para neurotransmissores ou neuromoduladores expressos em qualquer região do cérebro e espera-se que contribua para uma compreensão mais profunda dos mecanismos subjacentes à emoção e cognição.
Introduction
Os receptores de neurotransmissores estão localizados na superfície da membrana plasmática neuronal ou intracelularmente nas endomembranas (por exemplo, o endossomo, o retículo endoplasmático [RE] ou o aparelho trans-Golgi) e transitam dinamicamente entre esses dois compartimentos, dependendo de estados fisiológicos intrínsecos nos neurônios ou em resposta a atividades de redes neurais extrínsecas 1,2. Uma vez que os neurotransmissores recém-secretados provocam suas funções fisiológicas principalmente através do pool de receptores localizados na superfície, os níveis de receptores de superfície para um determinado neurotransmissor são um dos determinantes críticos de sua capacidade de sinalização dentro do circuito neural3.
Vários métodos estão disponíveis para monitorar os níveis de receptores de superfície em neurônios cultivados, incluindo o ensaio de biotinilação de superfície4, o ensaio de imunofluorescência com um anticorpo específico em condições não permeabilizadas5 ou o uso de um transgene de receptor geneticamente fundido com um indicador óptico fluorescente sensível ao pH (por exemplo, pHluorin)6. Por outro lado, essas abordagens são limitadas ou impraticáveis ao avaliar os níveis de receptores de superfície in vivo. Por exemplo, o procedimento de biotinilação de superfície pode não ser prático para processar grandes quantidades e números de amostras de tecidos cerebrais in vivo devido ao seu preço relativamente alto e às etapas subsequentes necessárias para purificar as proteínas biotiniladas em esferas conjugadas com avidina. Para neurônios embutidos na arquitetura tridimensional do cérebro, a baixa acessibilidade de anticorpos ou dificuldades na quantificação baseada em microscópio podem representar uma limitação significativa para avaliar os níveis de receptores de superfície in vivo. Para visualizar a distribuição dos receptores de neurotransmissores em cérebros intactos, métodos não invasivos, como a tomografia por emissão de pósitrons, poderiam ser usados para medir a ocupação do receptor e estimar os níveis de receptores de superfície7. No entanto, essa abordagem depende criticamente da disponibilidade de radioligantes específicos, equipamentos caros e conhecimentos especiais, tornando-a menos acessível para uso rotineiro pela maioria dos pesquisadores.
Aqui, descrevemos um método simples e versátil para medir os níveis de receptores de superfície em cérebros de animais experimentais ex vivo usando um reticulante químico solúvel em água, impermeável por membrana, bis(sulfosuccinimidil)suberato (BS3)8,9. BS3 tem como alvo aminas primárias na cadeia lateral de resíduos de lisina e pode covalentemente reticular proteínas em estreita proximidade umas das outras. Quando fatias cerebrais são preparadas na hora a partir de uma região de interesse e incubadas em um tampão contendo BS3, os receptores de superfície celular são reticulados com proteínas vizinhas e, assim, transformam-se em espécies de maior peso molecular, enquanto os receptores intracelulares associados à endomembrana permanecem inalterados. Portanto, os pools de receptores intracelulares e de superfície podem ser separados por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio e poliacrilamida (SDS-PAGE) e quantificados por western blot usando anticorpos específicos para o receptor a ser estudado.
O estresse crônico leve imprevisível (EMCU) é um paradigma experimental bem estabelecido para induzir estresse psicossocial crônico em roedores10. A SCMC provoca fenótipos comportamentais ansiosos/depressivos e déficits cognitivos por meio da modulação de uma série de sistemas de neurotransmissores, incluindo o GABA e seus receptores10,11. Em particular, o receptor GABA A contendo a subunidade α5 (α5-GABAA R) está implicado na regulação da memória e das funções cognitivas12,13, sugerindo o possível envolvimento de funções alteradas dessa subunidade em déficits cognitivos induzidos pelo SGCU. Neste protocolo, usamos o ensaio de reticulação BS3 para quantificar os níveis de α5-GABAAR expresso na superfície no córtex pré-frontal de camundongos expostos à EMCU em comparação com camundongos controles não estressados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora o impacto do estresse psicossocial crônico sobre comportamentos (i.e., emocionalidade e déficits cognitivos) e alterações moleculares (i.e., expressão reduzida de genes GABAérgicos e déficits associados na neurotransmissão GABAérgica) estejam bem documentados10, os mecanismos subjacentes a tais déficits precisam ser investigados mais adiante. Em particular, dado o estudo recente mostrando que o estresse crônico afeta significativamente o proteoma neuronal através da sobrecarga n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem à equipe do biotério do CAMH pelos cuidados com os animais durante todo o estudo. Este trabalho foi apoiado pelo Canadian Institute of Health Research (CIHR Project Grant #470458 to T.T.), pelo Discovery Fund do CAMH (para T.P.), pela National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (prêmio NARSAD #25637 para E.S.) e pelo Campbell Family Mental Health Research Institute (para E.S.). E.S. é o fundador da Damona Pharmaceuticals, uma biofarmacêutica dedicada a trazer novos compostos gabaérgicos para a clínica.
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors – Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors – Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
References
- Groc, L., Choquet, D. Linking glutamate receptor movements and synapse function. Science. 368 (6496), (2020).
- Diering, G. H., Huganir, R. L. The AMPA receptor code of synaptic plasticity. Neuron. 100 (2), 314-329 (2018).
- Tomoda, T., Hikida, T., Sakurai, T. Role of DISC1 in neuronal trafficking and its implication in neuropsychiatric manifestation and neurotherapeutics. Neurotherapeutics. 14 (3), 623-629 (2017).
- Sumitomo, A., et al. Ulk2 controls cortical excitatory-inhibitory balance via autophagic regulation of p62 and GABAA receptor trafficking in pyramidal neurons. Human Molecular Genetics. 27 (18), 3165-3176 (2018).
- Brady, M. L., Jacob, T. C. Synaptic localization of α5 GABA (A) receptors via gephyrin interaction regulates dendritic outgrowth and spine maturation. Developmental Neurobiology. 75 (11), 1241-1251 (2015).
- Jacob, T. C., et al. Gephyrin regulates the cell surface dynamics of synaptic GABAA receptors. The Journal of Neuroscience. 25 (45), 10469-10478 (2005).
- Takamura, Y., Kakuta, H. In vivo receptor visualization and evaluation of receptor occupancy with positron emission tomography. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (9), 5226-5251 (2021).
- Archibald, K., Perry, M. J., Molnár, E., Henley, J. M. Surface expression and metabolic half-life of AMPA receptors in cultured rat cerebellar granule cells. Neuropharmacology. 37 (10-11), 1345-1353 (1998).
- Boudreau, A. C., et al. A protein crosslinking assay for measuring cell surface expression of glutamate receptor subunits in the rodent brain after in vivo treatments. Current Protocols in Neuroscience. , 1-19 (2012).
- Fee, C., Banasr, M., Sibille, E. Somatostatin-positive gamma-aminobutyric acid interneuron deficits in depression: Cortical microcircuit and therapeutic perspectives. Biological Psychiatry. 82 (8), 549-559 (2017).
- Bernardo, A., et al. Symptomatic and neurotrophic effects of GABAA receptor positive allosteric modulation in a mouse model of chronic stress. Neuropsychopharmacology. 47 (9), 1608-1619 (2022).
- Prévot, T., Sibille, E. Altered GABA-mediated information processing and cognitive dysfunctions in depression and other brain disorders. Molecular Psychiatry. 26 (1), 151-167 (2021).
- Martin, L. J., et al. Alpha5GABAA receptor activity sets the threshold for long-term potentiation and constrains hippocampus-dependent memory. The Journal of Neuroscience. 30 (15), 5269-5282 (2010).
- Nollet, M. Models of depression: Unpredictable chronic mild stress in mice. Current Protocols. 1 (8), e208 (2021).
- Tomoda, T., Sumitomo, A., Newton, D., Sibille, E. Molecular origin of somatostatin-positive neuron vulnerability. Molecular Psychiatry. 27 (4), 2304-2314 (2022).
- Guilloux, J. P., et al. Molecular evidence for BDNF- and GABA-related dysfunctions in the amygdala of female subjects with major depression. Molecular Psychiatry. 17 (11), 1130-1142 (2012).
- Lin, L. C., Sibille, E. Somatostatin, neuronal vulnerability and behavioral emotionality. Molecular Psychiatry. 20 (3), 377-387 (2015).
- Fritschy, J. M., Mohler, H. GABAA-receptor heterogeneity in the adult rat brain: differential regional and cellular distribution of seven major subunits. The Journal of Comparative Neurology. 359 (1), 154-194 (1995).
- Rubio, F. J., Li, X., Liu, Q. R., Cimbro, R., Hope, B. T. Fluorescence activated cell sorting (FACS) and gene expression analysis of Fos-expressing neurons from fresh and frozen rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (114), e54358 (2016).
- Boudreau, A. C., Wolf, M. E. Behavioral sensitization to cocaine is associated with increased AMPA receptor surface expression in the nucleus accumbens. The Journal of Neuroscience. 25 (40), 9144-9151 (2005).
- Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
- Tomoda, T., et al. BDNF controls GABAAR trafficking and related cognitive processes via autophagic regulation of p62. Neuropsychopharmacology. 47 (2), 553-563 (2022).
- Hernandez-Rabaza, V., et al. Sildenafil reduces neuroinflammation and restores spatial learning in rats with hepatic encephalopathy: Underlying mechanisms. Journal of Neuroinflammation. 12, 195 (2015).
