BS3 화학 가교 분석: 설치류 뇌의 세포 표면 GABAA 수용체 표현에 대한 만성 스트레스의 영향 평가
Summary
BS3 화학적 가교 분석은 만성 심리사회적 스트레스 조건 하에서 마우스 뇌에서 감소된 세포 표면 GABAA 수용체 발현을 보여줍니다.
Abstract
불안은 인지 기능을 포함하여 동물의 행동에 다양한 영향을 미치는 감정 상태입니다. 불안의 행동 징후는 동물계 전체에서 관찰되며 광범위한 스트레스 양식에 대한 적응 또는 부적응 반응으로 인식될 수 있습니다. 설치류는 분자, 세포 및 회로 수준에서 불안의 통합 메커니즘을 다루는 번역 연구를 위한 입증된 실험 모델을 제공합니다. 특히, 만성 심리사회적 스트레스 패러다임은 인간과 설치류 사이에 유사한 불안/우울과 유사한 행동 표현형을 모방하는 부적응 반응을 유도합니다. 이전 연구에서는 만성 스트레스가 뇌의 신경 전달 물질 함량에 상당한 영향을 미치는 것으로 나타났지만 신경 전달 물질 수용체 수준에 대한 스트레스의 영향은 충분히 연구되지 않았습니다. 이 기사에서는 특히 감정과 인지의 조절과 관련된 감마-아미노부티르산(GABA) 수용체에 초점을 맞춰 만성 스트레스를 받는 생쥐에서 신경 전달 물질 수용체의 신경 전달 물질 수용체의 신경 표면 수준을 정량화하는 실험 방법을 제시합니다. 막 불 투과성 비가역성 화학 가교제 인 bissulfosuccinimidyl suberate (BS3)를 사용하여 만성 스트레스가 전두엽 피질에서 GABAA 수용체의 표면 가용성을 상당히 하향 조절한다는 것을 보여줍니다. GABAA 수용체의 신경 표면 수준은 GABA 신경 전달에 대한 속도 제한 과정이므로 실험 동물 모델에서 불안 / 우울 유사 표현형의 정도에 대한 분자 마커 또는 프록시로 사용될 수 있습니다. 이 가교 접근법은 모든 뇌 영역에서 발현되는 신경 전달 물질 또는 신경 조절제에 대한 다양한 수용체 시스템에 적용할 수 있으며 감정과 인지의 기본 메커니즘에 대한 더 깊은 이해에 기여할 것으로 기대됩니다.
Introduction
신경전달물질 수용체는 뉴런 원형질막 표면 또는 세포내막(예: 엔도솜, 소포체[ER] 또는 트랜스-골지체)에 국한되어 있으며, 뉴런의 내재적 생리학적 상태 또는 외인성 신경망 활동에 대한 반응에 따라 이 두 구획 사이를 동적으로 왕복합니다 1,2. 새로 분비된 신경전달물질은 주로 표면에 국한된 수용체 풀을 통해 생리적 기능을 이끌어내기 때문에, 주어진 신경전달물질에 대한 표면 수용체 수준은 신경 회로 내에서 신호 전달 능력의 중요한 결정 요인 중 하나이다3.
배양된 뉴런의 표면 수용체 수준을 모니터링하기 위해 표면 비오티닐화 분석(surface biotinylation) 분석법4, 비투과화 조건에서 특정 항체를 사용한 면역형광분석법(immunofluorescence assay)5, pH 민감성 형광 광학 지시약(예: pHluorin)6과 유전적으로 융합된 수용체 이식유전자(receptor transgene)의 사용을 포함하여 여러 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 대조적으로, 이러한 접근법은 생체 내에서 표면 수용체 수준을 평가할 때 제한적이거나 비실용적입니다. 예를 들어, 표면 비오티닐화 절차는 상대적으로 높은 가격과 아비딘-접합 비드 상에서 비오티닐화된 단백질을 정제하는 데 필요한 후속 단계로 인해 생체 내 뇌 조직의 대량 및 샘플 수를 처리하는 데 실용적이지 않을 수 있습니다. 3차원 뇌 구조에 내장된 뉴런의 경우 항체 접근성이 낮거나 현미경 기반 정량화의 어려움으로 인해 생체 내 표면 수용체 수준을 평가하는 데 상당한 제한이 있을 수 있습니다. 온전한 뇌에서 신경전달물질 수용체의 분포를 시각화하기 위해, 양전자 방출 단층촬영과 같은 비침습적 방법을 사용하여 수용체 점유를 측정하고 표면 수용체 수준을 추정할 수 있다7. 그러나 이 접근 방식은 특정 무선 리간드의 가용성, 고가의 장비 및 특수 전문 지식에 크게 의존하므로 대부분의 연구자가 일상적으로 사용하기에 접근하기 어렵습니다.
여기에서는 수용성, 막 불투과성 화학 가교제인 비스(설포숙신이미딜)수베레이트(BS3)8,9를 사용하여 생체 외에서 실험 동물 뇌의 표면 수용체 수준을 측정하는 간단하고 다재다능한 방법을 설명합니다. BS3는 라이신 잔기의 측쇄에 있는 1차 아민을 표적으로 하며 서로 가까운 거리에서 단백질을 공유 결합할 수 있습니다. 관심 영역에서 뇌 조각을 갓 준비하고 BS3를 포함하는 완충액에서 배양하면 세포 표면 수용체는 이웃 단백질과 가교되어 더 높은 분자량 종으로 변형되는 반면 세포 내 막내 관련 수용체는 변형되지 않은 상태로 유지됩니다. 따라서, 표면 및 세포내 수용체 풀은 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 분리되고 연구하고자 하는 수용체에 특이적인 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 정량화될 수 있다.
예측할 수 없는 만성 경미한 스트레스(UCMS)는 설치류에서 만성 심리사회적 스트레스를 유발하기 위한 잘 확립된 실험 패러다임이다10. UCMS는 GABA 및 그 수용체를 포함한 일련의 신경 전달 물질 시스템의 조절을 통해 불안/우울과 유사한 행동 표현형 및 인지 장애를 유발합니다10,11. 특히, α5 서브유닛 함유 GABAA 수용체(α5-GABAAR)는 기억 및 인지 기능의 조절에 연루되어 있으며(12,13), 이는 UCMS 유도 인지 결핍에서 이 서브유닛의 변경된 기능이 관여할 수 있음을 시사합니다. 이 프로토콜에서 우리는 BS3 가교 분석을 사용하여 스트레스를 받지 않은 대조군 마우스와 비교하여 UCMS에 노출된 마우스의 전두엽 피질에서 표면 발현된 α5-GABAAR의 수준을 정량화했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
만성적인 심리사회적 스트레스가 행동(즉, 감정 및 인지 장애)과 분자 변화(즉, GABAergic 유전자의 발현 감소 및 GABAergic 신경전달의 수반되는 결핍)에 미치는 영향은 잘 문서화되어 있지만10, 이러한 결핍의 기저에 있는 메커니즘은 추가 조사가 필요하다. 특히, 만성 스트레스가 ER 기능에 과부하를 일으켜 신경세포 프로테옴에 상당한 영향을 미치고 따라서 ER 스트레스가 상승한다?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 연구 기간 동안 동물을 돌봐준 CAMH 동물 시설 직원에게 감사를 표합니다. 이 연구는 캐나다 보건 연구소 (CIHR 프로젝트 보조금 # 470458 TT), CAMH의 디스커버리 펀드 (TP), 정신 분열증 및 우울증 연구를위한 전국 연합 (NARSAD 상 # 25637 ES) 및 캠벨 가족 정신 건강 연구소 (ES). E.S.는 새로운 GABAergic 화합물을 클리닉에 도입하는 데 전념하는 바이오 제약 회사인 Damona Pharmaceuticals의 설립자입니다.
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
| 2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| 4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
| Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
| Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
| Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
| Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
| Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
| GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
| GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
| Glycine | Sigma | W328707 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
| Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
| Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
| Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors – Serrated |
| Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors – Sharp |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
| Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
| Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
| Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
| Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |
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