BS3 kjemisk tverrbindingsanalyse avslører redusert celleoverflate GABAA-reseptoruttrykk i musehjerner under kroniske psykososiale stressforhold.
Angst er en tilstand av følelser som varierende påvirker dyrs atferd, inkludert kognitive funksjoner. Atferdsmessige tegn på angst observeres over hele dyreriket og kan gjenkjennes som enten adaptive eller maladaptive responser på et bredt spekter av stressmodaliteter. Gnagere gir en bevist eksperimentell modell for translasjonsstudier som adresserer de integrerende mekanismene for angst på molekylært, cellulært og kretsnivå. Spesielt fremkaller det kroniske psykososiale stressparadigmet maladaptive responser som etterligner angst-/depressiv-lignende atferdsfenotyper som er analoge mellom mennesker og gnagere. Mens tidligere studier viser signifikante effekter av kronisk stress på nevrotransmitterinnholdet i hjernen, er effekten av stress på nevrotransmitterreseptornivåer understudert. I denne artikkelen presenterer vi en eksperimentell metode for å kvantifisere nevronoverflatenivåene av nevrotransmitterreseptorer hos mus under kronisk stress, spesielt med fokus på gamma-aminosmørsyre (GABA) reseptorer, som er involvert i reguleringen av følelser og kognisjon. Ved å bruke den membrangjennomtrengelige irreversible kjemiske kryssbinderen, bissulfosuccinimidyl suberate (BS3), viser vi at kronisk stress signifikant nedregulerer overflatetilgjengeligheten av GABAA-reseptorer i prefrontal cortex. De nevrale overflatenivåene av GABAA-reseptorer er den hastighetsbegrensende prosessen for GABA-nevrotransmisjon og kan derfor brukes som en molekylær markør eller en proxy for graden av angst-/depressiv-lignende fenotyper i eksperimentelle dyremodeller. Denne tverrbindingstilnærmingen gjelder for en rekke reseptorsystemer for nevrotransmittere eller nevromodulatorer uttrykt i en hvilken som helst hjernegruppe, og forventes å bidra til en dypere forståelse av mekanismene som ligger til grunn for følelser og kognisjon.
Nevrotransmitterreseptorer er lokalisert enten på den neuronale plasmamembranoverflaten eller intracellulært på endomembranene (f.eks. endosomet, endoplasmatisk retikulum [ER] eller trans-Golgi-apparatet) og dynamisk skyttelbuss mellom disse to rommene avhengig av inneboende fysiologiske tilstander i nevroner eller som respons på ytre nevrale nettverksaktiviteter 1,2. Siden nylig utskilte nevrotransmittere fremkaller sine fysiologiske funksjoner primært gjennom det overflatelokaliserte bassenget av reseptorer, er overflatereseptornivåene for en gitt nevrotransmitter en av de kritiske determinantene for signalkapasiteten i nevralkretsen3.
Flere metoder er tilgjengelige for å overvåke overflatereseptornivåer i dyrkede nevroner, inkludert overflatebiotinyleringsanalysen4, immunfluorescensanalysen med et spesifikt antistoff i ikke-permeabiliserte tilstander5, eller bruk av et reseptortransgen genetisk fusjonert med en pH-sensitiv fluorescerende optisk indikator (f.eks. pHluorin)6. Derimot er disse tilnærmingene enten begrensede eller upraktiske ved vurdering av overflatereseptornivåer in vivo. For eksempel kan overflatebiotinyleringsprosedyren ikke være praktisk for behandling av store mengder og prøvenummer av in vivo hjernevev på grunn av den relativt høye prisen og de påfølgende trinnene som er nødvendige for rensing av biotinylerte proteiner på avidinkonjugerte perler. For nevroner innebygd i tredimensjonal hjernearkitektur kan lav antistofftilgjengelighet eller vanskeligheter med mikroskopbasert kvantifisering utgjøre en betydelig begrensning for å vurdere overflatereseptornivåene in vivo. For å visualisere fordelingen av nevrotransmitterreseptorer i intakte hjerner, kan ikke-invasive metoder, som positronemisjonstomografi, brukes til å måle reseptorbelegg og estimere overflatereseptornivåene7. Denne tilnærmingen er imidlertid kritisk avhengig av tilgjengeligheten av spesifikke radioligander, dyrt utstyr og spesialkompetanse, noe som gjør det mindre tilgjengelig for rutinemessig bruk av de fleste forskere.
Her beskriver vi en enkel, allsidig metode for å måle overflatereseptornivåer i eksperimentelle dyrehjerner ex vivo ved bruk av en vannløselig, membrangjennomtrengelig kjemisk kryssbinder, bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3)8,9. BS3 retter seg mot primære aminer i sidekjeden av lysinrester og kan kovalent kryssbinde proteiner i nærheten av hverandre. Når hjerneskiver tilberedes ferskt fra et område av interesse og inkuberes i en buffer som inneholder BS3, krysses celleoverflatereseptorene med naboproteiner og transformeres dermed til arter med høyere molekylvekt, mens de intracellulære endomembranassosierte reseptorene forblir umodifiserte. Derfor kan overflate- og intracellulære reseptorpooler separeres ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og kvantiteres ved western blot ved bruk av antistoffer som er spesifikke for reseptoren som skal studeres.
Uforutsigbart kronisk mildt stress (UCMS) er et veletablert eksperimentelt paradigme for å indusere kronisk psykososialt stress hos gnagere10. UCMS fremkaller angst-/depressiv-lignende atferdsfenotyper og kognitive underskudd via modulering av en rekke nevrotransmittersystemer, inkludert GABA og dets reseptorer10,11. Spesielt er α5-underenheten som inneholder GABA A-reseptoren (α5-GABAA R)involvert i reguleringen av minne og kognitive funksjoner12,13, noe som tyder på mulig involvering av endrede funksjoner i denne underenheten i UCMS-induserte kognitive underskudd. I denne protokollen brukte vi BS3-kryssbindingsanalysen for å kvantitere nivåer av overflateuttrykt α5-GABAAR i prefrontal cortex hos mus utsatt for UCMS sammenlignet med ikke-stressede kontrollmus.
Selv om virkningen av kronisk psykososialt stress på atferd (dvs. emosjonalitet og kognitive underskudd) og molekylære endringer (dvs. redusert ekspresjon av GABAerge gener og tilhørende underskudd i GABAerg nevrotransmisjon) er godt dokumentert10, må mekanismene som ligger til grunn for slike underskudd undersøkes nærmere. Spesielt, gitt den nylige studien som viser at kronisk stress signifikant påvirker nevronproteomet gjennom overbelastning på ER-funksjonene og dermed forhøyet ER-stres…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker CAMH dyreavdelingens ansatte for å ta vare på dyrene i løpet av studietiden. Dette arbeidet ble støttet av Canadian Institute of Health Research (CIHR Project Grant # 470458 til TT), Discovery Fund fra CAMH (til TP), National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD award # 25637 til ES), og Campbell Family Mental Health Research Institute (til ES). E.S. er grunnleggeren av Damona Pharmaceuticals, et biofarmasøytisk selskap dedikert til å bringe nye GABAergiske forbindelser til klinikken.
0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
10x TBS | Bio-Rad | 1706435 | |
2.5 M (45%, w/v) Glucose | Sigma | G8769 | |
2-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
4x SDS sample buffer (Laemmli) | Bio-Rad | 1610747 | |
Bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3) | Pierce | A39266 | No-Weigh Format; 10 x 2 mg |
Brain matrix | Ted Pella | 15003 | For mouse, 30 g adult, coronal, 1 mm |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
Curved probe | Fine Science Tools | 10088-15 | Gross Anatomy Probe; angled 45 |
Deionized water | milli-Q | EQ 7000 | Ultrapure water [resistivity 18.2 MΩ·cm @ 25 °C; total organic carbon (TOC) ≤ 5 ppb] |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | |
Filter paper (3MM) | Whatman | 3030-917 | |
Forceps (large) | Fine Science Tools | 11152-10 | Extra Fine Graefe Forceps |
Forceps (small) | Fine Science Tools | 11251-10 | Dumont #5 Forceps |
GABA-A R alpha 5 antibody | Invitrogen | PA5-31163 | Polyclonal Rabbit IgG; detect erroneous signal upon chemical crosslinking |
GABA-A R alpha 5 C-terminus antibody | R&D Systems | PPS027 | Polyclonal Rabbit IgG; cross-reacts with mouse and rat |
Glycine | Sigma | W328707 | |
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Bio-Rad | 1721019 | |
Magnesium chloride (MgCl2·6H2O) | Sigma | M2670 | |
Nonidet-P40, substitute (NP-40) | SantaCruz | 68412-54-4 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
PVDF membrane | Bio-Rad | 1620177 | |
Scissors (large) | Fine Science Tools | 14007-14 | Surgical Scissors – Serrated |
Scissors (small) | Fine Science Tools | 14060-09 | Fine Scissors – Sharp |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma | S9888 | |
Sonicator (Qsonica Sonicator Q55) | Qsonica | 15338284 | |
Table-top refregerated centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
Tissue punch (ID 1 mm) | Ted Pella | 15110-10 | Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0 mm, OD 1.27 mm |
Trans-Blot Turbo 5x Transfer buffer | Bio-Rad | 10026938 | |
Tube rotator (LabRoller) | Labnet | H5000 |