Kombine Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve Adeno İlişkili Virüs Tek Kılavuzlu RNA Sistemi Kullanılarak Kahverengi Yağa Özgü Nakavt Farelerin Üretimi
Summary
Bu protokolde, kombine bir Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve adeno ilişkili virüs (AAV) tek kılavuzlu RNA (sgRNA) sisteminden yararlanarak kahverengi yağ dokusuna (BAT) özgü nakavt fareleri üretmek için teknik prosedürleri açıklıyoruz. Açıklanan adımlar, sgRNA’ların tasarımını, AAV-sgRNA parçacıklarının hazırlanmasını ve AAV’nin BAT loblarına mikroenjeksiyonunu içerir.
Abstract
Kahverengi yağ dokusu (BAT), biyoaktif moleküllerin salgılanması yoluyla endokrin bir organ olarak da işlev görebilen, enerji dağılımında uzmanlaşmış bir yağ deposudur. BAT’a özgü nakavt farelerin yaratılması, ilgili bir genin BAT aracılı enerji düzenlemesine katkısını anlamak için en popüler yaklaşımlardan biridir. Cre-LoxP sistemini kullanan geleneksel gen hedefleme stratejisi, dokuya özgü nakavt fareleri üretmek için temel yaklaşım olmuştur. Ancak, bu yaklaşım zaman alıcı ve sıkıcıdır. Burada, kombine bir Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve adeno-ilişkili virüs (AAV) tek kılavuzlu RNA (sgRNA) sistemi kullanarak BAT’a ilgi duyan bir genin hızlı ve verimli bir şekilde nakavt edilmesi için bir protokol açıklıyoruz. İnterskapuler BAT, kaslar arasındaki derin tabakada bulunur. Bu nedenle, AAV’yi görme alanı içinde BAT’a tam ve doğrudan enjekte etmek için BAT açığa çıkarılmalıdır. BAT’ye bağlanan Sultzer damarı gibi sempatik sinirlerin ve damarların zarar görmesini önlemek için uygun cerrahi kullanım çok önemlidir. Doku hasarını en aza indirmek için, BAT’ın üç boyutlu anatomik yerini ve teknik adımlarda gerekli olan cerrahi becerileri anlamak için kritik bir ihtiyaç vardır. Bu protokol, ilgilenilen geni hedef alan sgRNA’ların tasarımı, AAV-sgRNA parçacıklarının hazırlanması ve BAT’deki genlerin biyolojik işlevlerini incelemek için geniş çapta uygulanabilecek BAT’ye özgü nakavt fareleri üretmek için AAV’nin her iki BAT lobuna doğrudan mikroenjeksiyonu ameliyatı da dahil olmak üzere temel teknik prosedürleri vurgulamaktadır.
Introduction
Obezite dünya çapında önemli bir oranda artmakta ve geniş bir metabolik hastalık spektrumuna yol açmaktadır 1,2,3. Yağ dokusu bu patolojilerin anahtarıdır. İşlevsel olarak farklı iki yağ dokusu tipi, fazla kaloriyi depolayan beyaz yağ dokusu (WAT) ve termojenez için enerjiyi dağıtan kahverengi yağ dokusu (BAT) ve ilgili bej / brite yağıdır. BAT, enerji dağıtıcı işlevi ile tanınırken, distal organlarda metabolizmayı düzenleyen biyoaktif moleküllerin üretimi yoluyla endokrin fonksiyonlara da sahiptir 4,5. Kemirgenlerde yapılan çok sayıda çalışma, kahverengi veya bej yağın miktarının veya aktivitesinin arttırılmasının, enerji harcamasının artmasına ve insülin duyarlılığının artmasına neden olduğunu göstermiştir. İnsanlarda, saptanabilir BAT’lı kişilerde kardiyometabolik hastalık prevalansı anlamlı derecede düşüktür6. Bu nedenle, BAT obezite ile ilişkili metabolik sekeller 7,8,9 için mükemmel terapötik potansiyele sahiptir.
BAT gelişim ve fonksiyonunun fizyolojisini ve patofizyolojisini araştırmak ve bu süreçlerde yer alan moleküler mekanizmaları aydınlatmak için, BAT’ye özgü transgenik fare modeli tercih edilen bir yöntemdir10. Cre-LoxP rekombinasyon sistemi, fare genomunu düzenleyerek koşullu nakavt fareleri üretmek için en yaygın kullanılan araçtır. Bu sistem, ilgili genlerin doku/hücreye özgü bir şekilde modifikasyonunu (aşırı ekspresyon veya nakavt) sağlamıştır11. Ayrıca, seçici bir floresan muhabir genini eksprese ederek belirli bir hücre tipini etiketlemek için de kullanılabilir.
Son zamanlarda, Cre-LoxP sistem yaklaşımı, CRISPR-Cas9 teknolojisi ve adeno-ilişkili virüs (AAV) tek kılavuzlu RNA (sgRNA) sistemi12’nin birleştirilmesiyle daha da geliştirilmiştir. CRISPR-Cas9 sistemi, genom13’ün kesin bölgelerini değiştirmek, düzenlemek veya hedeflemek için spesifik ve etkili bir gen düzenleme aracıdır. CRISPR-Cas9 tabanlı genom düzenleme, genomik lokusların hızlı genetik manipülasyonuna izin verir, çünkü bir gen hedefleme vektörü ile homolog rekombinasyon gerektirmez. Kombine Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve AAV-sgRNA teknikleri, araştırmacıların dokularda / hücrelerde istenen zamanlarda ilgilenilen genlerin rolünün araştırılmasına izin vererek gen fonksiyonlarını daha kesin bir şekilde anlamalarını sağlar. Ek olarak, bu kombine teknikler transgenik fareler üretmek için gereken zamanı ve çabayı azaltır ve indüklenebilir bir Cre hattı kullanılıyorsa, farelerde indüklenebilir genom düzenlemesi için CRISPR-Cas9 aktivitesinin zamansal kontrolüne izin verir14.
AAV vektörleri in vivo gen dağıtım sistemlerinde güvenli ve etkilidir. Bununla birlikte, yağ dokusunu hedef alan AAV’ler, beyin, kalp, karaciğer ve kas15 gibi diğer dokulardaki uygulamaların gerisinde kalmıştır. Doğal olarak oluşan serotip vektörleri ile nispeten düşük transdüksiyon verimliliği ve tropizm nedeniyle, yağ dokusuna AAV rehberliğinde gen iletimi hala zordur15. Son 5 yılda, biz ve diğerleri, AAV rehberliğindeki genleri yağ dokusuna iletmek için etkili ve minimal invaziv yollar oluşturduk ve BAT fonksiyonunun düzenlenmesinde yer alan genleri anlamamızı sağlayan fare modelleri oluşturduk16,17,18,19. Örneğin, 12-lipoksijenazı (12-LOX) kodlayan Alox12’yi hedefleyen sgRNA’yı Ucp1-Cre / Cas9 farelerinin BAT’ına iletmek için AAV8’i kullanarak, aktive edilmiş BAT’ın glikoz metabolizmasını düzenlemek ve obezite ile ilişkili inflamasyonu çözmek için sırasıyla 12-hidroksi-eikosapentaenoik asit (12-HEPE) ve 13R, 14S-dihidroksi dokosaheksaenoik asit (maresin 2) olmak üzere 12-LOX metabolitleri ürettiğini keşfettik. 17. Burada, kombine Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve AAV-sgRNA sistemini kullanarak BAT’a özgü nakavt fareleri üretmek için teknik prosedürler, özellikle AAV-sgRNA’nın BAT loblarına doğrudan mikroenjeksiyonu için cerrahi konusunda adım adım bir protokol sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnterskapuler BAT’a AAV aracılı gen iletimi için mevcut yayınlanmış yöntemler, BAT’ye doğrudan AAV enjeksiyonu için cerrahi teknikleri ve yaklaşımı açıklayan ayrıntılı resimler ve videolar içermemektedir. Yayınlanan yöntemlerin çoğunda33,34, AAV, BAT’ın kendisi yerine interskapuler BAT’ı çevreleyen yağ dokularına enjekte edilir. Bu nedenle, bu protokolde çalışmanın başarısını belirleyen birkaç önemli adım vardır. Bunlar ara…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01DK122808, R01DK102898 ve R01DK132469 (Y.-H.T.’ye) ve P30DK036836 (Joslin Diyabet Merkezi Diyabet Araştırma Merkezi’ne) hibeleri ile desteklenmiştir. T.T., SUNSTAR Araştırma Bursu (Hiroo Kaneda Bursu, Sunstar Vakfı, Japonya) ve Amerikan Kalp Derneği hibe 903968 tarafından desteklenmiştir. Y. Z., Charles A. King Trust Fellowship tarafından desteklendi. Sean D. Kodani’ye makaleyi nazikçe düzelttiği için teşekkür ederiz.
Materials
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| OPTI-MEM serum-free medium | Invitrogen | 31985 | |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma | TR-1003-G | |
| TransIT-LT1 Transfection Reagent | Mirus | MIR 2300 | |
| Recombinant DNA | |||
| lentiCRISPR v2 vector | Addgene | 52961 | |
| pAAV-U6-BbsI-gRNA-CB-EmGFP | Addgene | 89060 | |
| pMD2.G envelope plasmid | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 packaging plasmid | Addgene | 12260 | |
| Experimental Models: Cell Lines | |||
| HEK-293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| WT-1 cells | Developed in Tseng lab | PMID: 14966273 | |
| Experimental Models: Organisms/Strains | |||
| Cas9 knockin mice | Jackson Laboratories | 24857 | |
| Ucp1-CRE mice | Jackson Laboratories | 24670 | |
| Others | |||
| Banamine | Patterson | 07-859-1323 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | Model 710 RN Syringe | |
| Hydrogen peroxide solution | Fisher Scientific | H325-500 | |
| Needle | Hamilton | 32 gauge, small hub RN needle, needle point style 2 | |
| Suture 5-0 Unify PCL25 P-3 Undyed 18 inch Monofilament 12/Bx | Henry Schein | 1273504 | |
| Suture 5-0 Unify Silk P-3 Black 18 inch 12/Bx | Henry Schein | 1294522 |
References
- Kopelman, P. G. Obesity as a medical problem. Nature. 404 (6778), 635-643 (2000).
- Finkelstein, E. A., et al. Obesity and severe obesity forecasts through 2030. American Journal of Preventive Medicine. 42 (6), 563-570 (2012).
- Craft, S. Insulin resistance and Alzheimer’s disease pathogenesis: Potential mechanisms and implications for treatment. Current Alzheimer Research. 4 (2), 147-152 (2007).
- Villarroya, F., Cereijo, R., Villarroya, J., Giralt, M. Brown adipose tissue as a secretory organ. Nature Reviews Endocrinology. 13 (1), 26-35 (2017).
- Scheele, C., Wolfrum, C. Brown adipose crosstalk in tissue plasticity and human metabolism. Endocrine Reviews. 41 (1), 53-65 (2020).
- Becher, T., et al. Brown adipose tissue is associated with cardiometabolic health. Nature Medicine. 27 (1), 58-65 (2021).
- Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and beige fat: Physiological roles beyond heat generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
- Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
- Darcy, J., Tseng, Y. H. ComBATing aging-does increased brown adipose tissue activity confer longevity. Geroscience. 41 (3), 285-296 (2019).
- da Silva Xavier, G., Hodson, D. J. Mouse models of peripheral metabolic disease. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism. 32 (3), 299-315 (2018).
- Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. Mouse Cre-LoxP system: General principles to determine tissue-specific roles of target genes. Laboratory Animal Research. 34 (4), 147-159 (2018).
- Wang, D., Zhang, F., Gao, G. CRISPR-based therapeutic genome editing: Strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell. 181 (1), 136-150 (2020).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology. 32 (4), 347-355 (2014).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33 (4), 390-394 (2015).
- Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: An emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
- Sugimoto, S., et al. Brown adipose tissue-derived MaR2 contributes to cold-induced resolution of inflammation. Nature Metabolism. 4 (6), 775-790 (2022).
- Leiria, L. O., et al. 12-lipoxygenase regulates cold adaptation and glucose metabolism by producing the omega-3 lipid 12-HEPE from brown fat. Cell Metabolism. 30 (4), 768-783 (2019).
- Shamsi, F., et al. FGF6 and FGF9 regulate UCP1 expression independent of brown adipogenesis. Nature Communications. 11, 1421 (2020).
- Romanelli, S. M., et al. BAd-CRISPR: Inducible gene knockout in interscapular brown adipose tissue of adult mice. Journal of Biological Chemistry. 297 (6), 101402 (2021).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9, 5416 (2018).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Sanjana, N. E., Shalem, O., Zhang, F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nature Methods. 11 (8), 783-784 (2014).
- Tseng, Y. H., Kriauciunas, K. M., Kokkotou, E., Kahn, C. R. Differential roles of insulin receptor substrates in brown adipocyte differentiation. Molecular and Cellular Biology. 24 (5), 1918-1929 (2004).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: Sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Jarrett, K. E., et al. Somatic genome editing with CRISPR/Cas9 generates and corrects a metabolic disease. Scientific Reports. 7, 44624 (2017).
- Zhang, Y., et al. Optimized RNA-targeting CRISPR/Cas13d technology outperforms shRNA in identifying functional circRNAs. Genome Biology. 22 (1), 41 (2021).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960 (2019).
- Jimenez, V., et al. In vivo adeno-associated viral vector-mediated genetic engineering of white and brown adipose tissue in adult mice. Diabetes. 62 (12), 4012-4022 (2013).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Huang, W., Queen, N. J., Cao, L. rAAV-mediated gene delivery to adipose tissue. Methods in Molecular Biology. 1950, 389-405 (2019).
- Xue, K., Wu, D., Qiu, Y. Specific and efficient gene knockout and overexpression in mouse interscapular brown adipocytes in vivo. STAR Protocols. 3 (4), 101895 (2022).
